MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CÉLULAS PROGENITORAS HEPÁTICAS BIPOTENTES.

Método de obtención de una mezcla de células de vertebrado enriquecidas en células progenitoras hepáticas que comprende:

(a) obtener una suspensión de células de vertebrado y (b) posteriormente en cualquier orden, o de manera sustancialmente simultánea, eliminar de la suspensión de células aquellas células que expresan al menos un antígeno del MHC de clase Ia y aislar de la suspensión de células aquellas células que son positivas para el antígeno ICAM-1, para proporcionar una mezcla de células enriquecida en células progenitoras.

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a marcadores de superficie celular novedosos que distinguen células hepáticas de células hematopoyéticas. En particular, la invención se refiere a métodos de aislamiento de células progenitoras hepáticas bipotentes con un fenotipo único que incluye células que son negativas para el antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I clásico, positivas para la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), y positivas amortiguadas (“dull positive”) para antígeno(s) del MHC de clase I no clásico. Además, la invención se refiere a las células progenitoras hepáticas y células madre hepáticas producidas mediante los métodos de la invención.

2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La identificación de poblaciones de células progenitoras multipotentes en tejidos de mamífero es importante tanto para intereses clínicos como comerciales y también para comprender los procesos de desarrollo y la hemostasia tisular. Las poblaciones de células progenitoras son dianas ideales para la terapia génica, el trasplante de células y para la ingeniería tisular de órganos bioartificiales (Millar, A.D. 1992 Nature 357, 455; Langer, R. y Vacanti, J.P. 1993 Science 260, 920; Gage, F.H. 1998 Nature 392, 18).

La existencia de células progenitoras o células madre “determinadas”), específicas de tejido que tienen alto potencial de crecimiento y/o pluripotencialidad es fácilmente evidente a partir de estudios sobre células madre hematopoyéticas (Spangrude et al. 1988 Science 241, 58), células madre neuronales (Davis, A.A., y Temple, S. 1994 Nature 372, 263; Stemple, D.L., y Anderson, D.J. 1992 Cell 71, 973) y células madre epidérmicas (Jones, P.H., y Watt,

F.M. 1993 Cell 73, 713), habiéndose identificado cada una mediante clonación mediante el uso de métodos particulares apropiados para ese tejido. Se consideran que estas células progenitoras son las células responsables de la hemostasia tisular hematopoyética, neuronal o epidérmica normal y de respuestas regenerativas tras lesión grave (Hall, P.A., y Watt,

F.M. 1989 Development 106, 619).

El hígado de un mamífero adulto tiene una tremenda capacidad para recuperarse tras o bien lesión hepatotóxica extensa o bien hepatectomía parcial (Fishback, F.C. 1929 Arch. Pathol. 7, 955); (Higgins, G.M., y Anderson, R.M. 1931 Arch. Pathol. 12, 186), pese a que el hígado es normalmente un tejido quiescente sin renovación rápida. Se ha interpretado que los datos de estudios recientes en ratón sugieren que las células parenquimatosas de adulto tienen un crecimiento casi ilimitado potencialmente al someterse a ensayo mediante experimentos de trasplante en serie (Overturf et al. 1997 Am. J. Pathol. 151, 1273); (Rhim, J.A. et al. 1994 Science 263, 1149). Estos experimentos usan poblaciones de células de hígado heterogéneas lo que limita la capacidad para demostrar el crecimiento potencial observado derivado de células parenquimatosas de adulto, a partir de una subpoblación de células parenquimatosas de adulto y/o de células no parenquimatosas (es decir, células progenitoras). Además, los estudios no muestran evidencia de diferenciación epitelial biliar, puesto que los huéspedes usados tenían o bien transgenes de albúmina-urocinasa, o bien, en el otro caso, una deficiencia en enzima catabólica de tirosina; ambos tipos de huéspedes tienen condiciones que se seleccionan para el linaje hepatocítico. Por tanto, el ensayo no pudo someter a prueba poblaciones de células bipotentes.

Varios estudios histológicos establecen que las células hepáticas tempranas de fetos a mitad de gestación tienen una bipotencialidad de desarrollo para diferenciarse en epitelio de conducto biliar así como en hepatocitos maduros (Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech. 39,328-35). El desarrollo hepático comienza en el endodermo del intestino anterior ventral inmediatamente después de que el epitelio del endodermo interacciona con el mesodermo cardiogénico (Douarin, N. M. 1975 Medical Biol. 53, 427); (Houssaint, E. 1980 Cell Differ. 9, 269). Este comportamiento hepático se produce en el día embrionario (E) 8 en el ratón. La fase inicial del desarrollo hepático se hace evidente con la inducción de ARNm de alfa-fetoproteína y albúmina sérica en el endodermo y antes de los cambios morfológicos (Gualdi, R. et al. 1996 Genes Dev. 10, 1670). En E 9,5 de la gestación del ratón, las células especificadas proliferan entonces y penetran en el mesénquima del septo traversa con una forma de tipo cuerda, formando el primordio hepático. Aunque la masa del hígado aumenta entonces drásticamente, el aumento en masa se debe en buena parte a las células hematopoyéticas, que colonizan el hígado fetal en E10 en el ratón (Houssaint, E.1981 Cell Differ. 10, 243) e influyen sobre las células hepáticas para mostrar una forma extremadamente distorsionada e irregular (Luzzatto, A.C. 1981 Cell Tissue Res. 215, 133). De manera interesante, los datos recientes de ratones mutantes con direccionamiento genético indican que la afectación de varios genes ha conducido a insuficiencia hepática letal, apoptosis y/o necrosis de células parenquimatosas entre E12 y E15 (Gunes, C. et al. 1998 EMBO J. 17, 2846; Hilberg, F. et al. 1993 Nature 365, 1791; Motoyama, J. et al. 1997 Mech. Dev. 66, 27; Schmidt, C. et al. 1995 Nature 373, 699). Especialmente, las alteraciones genéticas que forman parte de la cascada activada por estrés (Ganiatsas, S. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6881; Nishina, H. et al. 1999 Development 126, 505) o la cascada anti-apoptótica (Beg, A. et al. 1995 Nature 376, 167; Li, Q. et al. 1999 Science 284, 321; Tanaka, M. et al. 1999. Immunity 10, 421) pueden dar como resultado hepatogénesis gravemente afectada, pero no hematopoyesis, pese a la amplia expresión del gen inactivado. No está claro si las células hepáticas son intrínsecamente sensibles a los estímulos de estrés en el desarrollo o si el microentorno particular en el hígado fetal por sí mismo produce tales efectos destructivos (Doi, T.S. et al 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2994). Por otra parte, la arquitectura básica del hígado adulto depende de la aparición del cilindro inicial del epitelio del conducto biliar que rodea a la vena porta (Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech. 39, 328).

**(Ver fórmula)**

Desde el punto de vista inmunohistológico, el primer signo de la diferenciación de las células epiteliales del conducto biliar intrahepático es la expresión de la citoqueratina (CK) específica biliar. Las proteínas CK, las proteínas del filamento intermedio (FI) citoplasmático de las células epiteliales, se codifican por una familia de múltiples genes y se expresan de una manera específica de tejido y diferenciación (Moll, R. et al. 1982 Cell 31, 11). CK19 es uno de los marcadores biliares más notables, puesto que los hepatocitos adultos no expresan CK19 en absoluto, mientras que las células epiteliares biliares adultas sí expresan esta proteína. CK8 y CK18 sólo se expresan desde las células hepáticas tempranas hasta los hepatocitos adultos (Moll, R. et al. 1982 Cell 31, 11). En E15.5 en el desarrollo de rata, que corresponde a E14 en el ratón, los precursores biliares se tiñen intensamente por anticuerpos tanto frente a CK18 como frente a CK8, y algunos precursores biliares expresan CK19. A medida que avanza el desarrollo, los conductos biliares que están madurando expresan gradualmente CK7 además de CK19 y pierden la expresión de albúmina (Shiojiri, N. et al. 1991 Cancer Res. 51, 2611). Aunque se cree que las células hepáticas ya en E13 en la rata constituyen una población homogénea, todavía queda por comprobar si todas las células hepáticas tempranas pueden diferenciarse en el linaje de células epiteliales biliares, y cómo se determinan sus destinos. No se han realizado estudios de marcaje de linaje definitivos, tales como los que usan vectores retrovirales, para células hepáticas, y no se han identificado las condiciones de cultivo de clones necesarias para la demostración de cualquier célula progenitora hepática bipotente.

Para los análisis del crecimiento clonal, un obstáculo principal es la expansión explosiva de las células hematopoyéticas, que afecta a la capacidad de observar la expansión ex vivo de células hepáticas. Por tanto, debe usarse un proceso de enriquecimiento para la población hepática. Aunque se han investigado en detalle marcadores de superficie para poder fraccionar las células hematopoyéticas en hígado fetal (Dzierzak, E. et al. 1998 Immunol. Today 19, 228-36), los de las células progenitoras hepáticas todavía están poco definidos, puesto que los estudios están... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de una mezcla de células de vertebrado enriquecidas en células progenitoras hepáticas que comprende:

(a) obtener una suspensión de células de vertebrado y

(b) posteriormente en cualquier orden, o de manera sustancialmente simultánea, eliminar de la suspensión de células aquellas células que expresan al menos un antígeno del MHC de clase Ia y aislar de la suspensión de células aquellas células que son positivas para el antígeno ICAM-1, para proporcionar una mezcla de células enriquecida en células progenitoras.

2. Método para la identificación de células progenitoras hepáticas, que comprende:

(a) obtener una suspensión de células que se sospecha que incluye células progenitoras hepáticas; y

(b) identificar las células que expresan el antígeno ICAM-1 y no expresan el antígeno del MHC de clase Ia.

3. Método de obtención de una mezcla de células de vertebrado enriquecidas en células progenitoras hepáticas que comprende:

a) proporcionar una célula madre embrionaria de vertebrado, a excepción de las células madre embrionarias humanas,

b) expandir la célula madre embrionaria para producir una progenie de células madre embrionarias, y

c) aislar aquella progenie de células madre embrionarias que expresan al menos el antígeno ICAM-1 y no expresan el antígeno del MHC de clase Ia.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además aislar de la suspensión de células aquellas células que expresan al menos un antígeno del MHC de clase Ib.

5. Método según la reivindicación 2, que comprende además identificar las células que expresan al menos un antígeno del MHC de clase Ib.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la suspensión de células se obtiene de endodermo o médula ósea.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el endodermo se selecciona del grupo que consiste en hígado, páncreas, pulmón, intestino, tiroides, gónada y combinaciones de los mismos.