MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN AUTOMÁTICA DEL POTENCIAL ENDÓGENO DE TROMBINA.

Método para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra de sangre o plasma coagulados,

donde la cinética de reacción de un sustrato de trombina es medida como función del tiempo, caracterizado porque a) se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción dentro de una ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba, y después b) por medio de la pendiente A de la cinética de reacción en el rango lineal de la fase de saturación, la cual corresponde a la pendiente de la cinética α2MT, se determina de manera iterativa la constante de enlace C de trombina a la α2-macroglobulina según la ecuación: con C0 = 0 e i número índice para el valor de cinética de trombina T en el punto de tiempo ti, j número índice para las iteraciones, y entonces c) se determinan los valores de cinética α2MT y se sustraen de los valores asociados de la cinética total de reacción, y después d) mediante promedio de los valores de cinética de la trombina libre, los cuales fueron determinados para el rango lineal de la cinética total de reacción en la fase de saturación, se determina el valor bruto de PET

La presente invención se refiere a un método para la determinación automática del potencial endógeno de trombina en una muestra de sangre o plasma.

La regulación de la hemóstasis ocurre mediante la interacción de diferentes activadores, inhibidores, así como 5 mecanismos de retroalimentación positiva y negativa. Los defectos en esta estructura pueden conducir a un desbalance en el sistema de hemóstasis y tener como consecuencia bien sea una hemorragia o una trombosis.

La trombina, una serinproteasa, es la enzima central de la coagulación sanguínea plasmática, cuya función principal es la inducción de la polimerización de la fibrina y con ello la formación del coágulo. En caso de necesidad, la formación de trombina es puesta en marcha mediante la activación 10

de la molécula precursora enzimática inactiva protrombina. Para, en el caso de lesión, limitar local y temporalmente el proceso de coagulación, ocurre prontamente una restricción de la coagulación, entre otros mediante la complejación y con ello inactivación de la trombina libre, por factores inhibidores como por ejemplo antitrombina o α2-macroglobulina (α2M). Los desórdenes en el interior del proceso, que regula la formación o inhibición de trombina, pueden conducir a estados hiper- o bien hipocoagulatorios y con ello a desórdenes patológicos en la coagulación. 15 En la detección de la formación y la inhibición de la trombina está por consiguiente una inmensa significancia de los respectivos estados de coagulación.

La capacidad (potencial) intrínseca (endógena) de una muestra particular de plasma, en el caso de muestras de plasma, para la formación e inhibición de trombina libre enzimáticamente activa es definida también como potencial endógeno de trombina (PET). Puesto que todos los componentes biológicos que están presentes en material de 20 ensayo y pueden influir en la inhibición y formación de trombina, condicionan el potencial individual de trombina de una muestra, la determinación de PET es adecuada tanto como prueba global, con la que pueden incluirse los componentes del sistema de hemóstasis, como también para la vigilancia de medidas terapéuticas.

Un parámetro que es determinado preferiblemente para la cuantificación del potencial endógeno de trombina y que en la literatura es definido también como "potencial endógeno de trombina", es la integral de tiempo/concentración o 25 bien la superficie bajo la curva de la formación de trombina [ver EP 0 420 332-B1, EP 0 802 986-B1 y Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624]. Este parámetro es una medida de la cantidad y de la actividad de la trombina endógena, la cual estaba presente desde un tiempo t = 0 en una muestra de sangre o plasma coagulada.

Para la determinación del PET, en una muestra de sangre o plasma que tiene la capacidad de coagular, se mide el rendimiento cinético de un sustrato de trombina por la liberación de un indicador medible. Puesto que la 30 concentración de sustrato de trombina es ajustada de modo que en el curso de la reacción el sustrato no puede ser consumido completamente, la cantidad de un indicador liberado se comporta idealmente de modo proporcional a la actividad enzimática de la trombina formada en el transcurso de la reacción de coagulación.

Sin embargo, se sabe que con los sustratos actualmente disponibles de trombina, los cuales exhiben un tamaño de molécula inferior a 8 kD, adicionalmente a la actividad fisiológicamente relevante de la trombina libre también se 35 mide la actividad fisiológicamente irrelevante del complejo α2-macroglobulina-trombina (α2MT). A partir de la medición de la cantidad de indicador liberado a lo largo del tiempo resulta una cinética de reacción, la cual no alcanza ninguna fase de plató a pesar de lo avanzada y finalmente completa inhibición de la trombina libre, sino que se eleva nuevamente.

Para deducir la cinética de la trombina fisiológicamente relevante T(t) proveniente de la cinética total de reacción 40 medida, debe determinarse de manera conocida la fracción α2MT (t) de la actividad del complejo α2MT y sustraerlo de la cinética total K (t):

La cantidad de complejo α2MT es directamente dependiente de la cantidad de trombina libre. A partir de la molécula precursora enzimáticamente inactiva de la protrombina se forma primero que todo la trombina libre, la cual es 45 formada directamente a partir de la α2-macroglobulina, mediante lo cual se forma el complejo α2MT relativamente estable. Puesto que también la concentración del complejo α2MT cambia en el curso de la reacción de modo proporcional a la concentración de trombina, se describió como ecuación diferencial la correlación matemática entre la cinética de trombina T (t) y la cinética α2MT (t) del complejo α2MT [Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624]: 50

con

 diferencial parcial

α2MT (t) concentración del complejo α2-macroglobulina-trombina en el punto de tiempo t

T (t) concentración de trombina en el punto de tiempo t

C constante para el enlace de trombina a α2M. 5

Los métodos de valoración hasta ahora conocidos para la determinación del potencial endógeno de trombina o bien de la concentración de trombina libre [Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624; WO 2004/016807-A1, Wielders et al, Thromb. Haemostasis 77: 629-636; Kessels et al, Comput. Biol. Med. 24 : 277-288] describen vías muy complejas para la solución de esta ecuación diferencial (2). El método conocido determina la cinética del complejo α2-macroglobulina-trombina, según la cual se forma, antes de todo, la primera derivada de la cinética total 10 de reacción. Los promedios necesarios resultantes de este procedimiento de analítico pueden en suma conducir a inexactitudes. Para la determinación de las constantes C para el enlace de trombina a la α2-macroglobulina se indican métodos complejos de optimización, por ejemplo el método modificado de Newton del programa de software "Microsoft EXCEL Solver", cuya especificación la mayoría de las veces no es conocida para el usuario y la cual tampoco no siempre llega a un resultado. Además se consideran una serie de parámetros enzimocinéticos, como 15 por ejemplo las constantes de Michaelis de sustratos específicos para, partiendo de la cantidad de sustrato que reaccionó, poder inferir la cantidad de trombina libre. Estos parámetros específicos de sustrato tienen que ser bien sea conocidos a partir de la literatura o calculados en pruebas previas para el sustrato empleado.

La realización del método conocido hasta ahora para la determinación del potencial endógeno de trombina en equipos que pueden emplearse en el laboratorio de coagulación, es limitada en tanto que debido a la complejidad 20 del método conocido hasta ahora es indispensable una elevada capacidad de almacenamiento de datos y resulta un tiempo de cálculo relativamente largo. Para laboratorios diagnósticos que tienen que cumplir con una elevada capacidad de procesamiento de muestras, por razones de capacidad son una desventaja particular los largos tiempos de procesamiento.

La presente invención basó por consiguiente su objetivo en poner a disposición un método simplificado que hiciera 25 posible una determinación rápida y segura del potencial endógeno de trombina en equipos comunes de análisis para el diagnóstico de la coagulación.

La solución de este objetivo es la puesta a disposición de los métodos y elementos acordes con la invención descritos en las reivindicaciones.

La presente invención para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra incluye 30

1. La determinación, conocida por el experto de la cinética de reacción de un sustrato de trombina como función del tiempo y

2. La determinación acorde con la invención de un valor bruto PET, el cual hace posible la cuantificación del potencial endógeno de trombina de una muestra.

La medición de la cinética de reacción de un sustrato de trombina, necesaria para la determinación del potencial 35 endógeno, exige que la muestra analizada sea mezclada con un sustrato de trombina, el cual induce la formación de trombina, por ejemplo mediante la adición de un activador de formación de trombina, y exige que se mida una propiedad física o química del sustrato...

1. Método para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra de sangre o plasma coagulados, donde la cinética de reacción de un sustrato de trombina es medida como función del tiempo, caracterizado porque

a) se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción dentro de una ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba, y después 5

b) por medio de la pendiente A de la cinética de reacción en el rango lineal de la fase de saturación, la cual corresponde a la pendiente de la cinética α2MT, se determina de manera iterativa la constante de enlace C de trombina a la α2-macroglobulina según la ecuación:

con C0 = 0 10

e

i número índice para el valor de cinética de trombina T en el punto de tiempo ti,

j número índice para las iteraciones,

y entonces

c) se determinan los valores de cinética α2MT y se sustraen de los valores asociados de la cinética total de 15 reacción, y después

d) mediante promedio de los valores de cinética de la trombina libre, los cuales fueron determinados para el rango lineal de la cinética total de reacción en la fase de saturación, se determina el valor bruto de PET.

2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la ventana tiempo específica de la prueba abarca por lo menos 3 puntos de medida dentro de la fase de saturación. 20

3. Método según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque con ayuda de un método de regresión se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción medida.

4. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque para cada ventana de tiempo posible, cuyo punto final corresponde al punto final de la ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba y cuyo punto de inicio corresponde al punto de inicio de la ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba o un punto 25 cualquiera de medida dentro de la ventana de tiempo predeterminada, se forma el cuadrado del coeficiente de correlación r de Pearson.

5. Método según la reivindicación 4 caracterizado porque se determina el máximo del cuadrado del coeficiente de correlación ri y como rango lineal de la cinética total de reacción se elige la ventana de tiempo con el valor máximo.

6. Método según la reivindicación 5 caracterizado porque para el caso en el que el rango lineal determinado esté 30 por debajo de un ancho mínimo definido, se elige como rango lineal una ventana de un ancho mínimo previamente definido.

7. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la pendiente A de la cinética total de reacción es calculada en el rango lineal de la fase de saturación con ayuda de una regresión lineal.

8. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque con ayuda de un método para el cálculo de 35 compensación se minimizan las desviaciones de la pendiente calculada de α2MT frente a la pendiente A de la cinética total de reacción, debidas a variación de las constantes de enlace C de trombina a α2M.

9. Método según la reivindicación 8 caracterizado porque se emplea el método de mínimos cuadrados como método para la compensación de cálculo.

10. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el cálculo de la serie de tiempo de los valores de la 40 cinética α2MT es llevado a cabo mediante aplicación del método de las diferencias finitas.

11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque con el coeficiente de variación de los valores de la cinética de la trombina libre en el rango lineal, ocurre un control de calidad del valor bruto de PET.

12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque puede fijarse el estatus de coagulación de un paciente o bien de una muestra de un paciente, mediante la comparación con el valor bruto de PET de una muestra estándar normal.

13. Equipo adecuado para la determinación del potencial endógeno de trombina caracterizado porque allí está implementado un método para la determinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12. 5