Método para el diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis preclínica o clínica,

que comprende las siguientes etapas: a) detectar la unión específica de una muestra líquida a un anticuerpo de L. intracellularis, en donde los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal 301:39 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205, anticuerpo monoclonal 287:6 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203, anticuerpo monoclonal 268:29 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206, anticuerpo monoclonal 110:9 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204, anticuerpo monoclonal 113:2 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 y anticuerpo monoclonal 268:18 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092202, b) comparar el resultado obtenido en a) con un control

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la salud animal y en particular a Lawsonia intracellularis. En particular, la invención se refiere a un método de diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis y a un kit de ensayo de diagnóstico usando anticuerpos específicos de Lawsonia intracellularis. La invención también se refiere al uso del método o del kit de ensayo para diagnosticar infecciones por Lawsonia intracellularis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

L. intracellularis, el agente causante de enteropatía proliferativa porcina (“EPP”), afecta prácticamente a todos los animales, incluyendo: seres humanos, conejos, hurones, hámsters, zorro, caballos y otros animales tan diversos como avestruces y emús. L. intracellularis es una causa particularmente grande de pérdidas en manadas de animales de la especie porcina en Europa así como en los Estados Unidos

Una característica coherente de la EPP es la presencia de bacilos intracitoplasmáticos curvados, no ligados a membrana, dentro de enterocitos en las porciones del intestino afectadas. Las bacterias asociadas con EPP se han referido como “organismos de tipo Campylobacter.” S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1.989). Se han identificado posteriormente las bacterias causantes como un género y una especie taxonómicos, nuevos, denominados en nuestro idioma simbionte ileal (siglas inglesas: IS) intracellular. (C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1.993). Más recientemente, se ha dado a estas nuevas bacterias el nombre taxonómico Lawsonia (L.) intracellularis S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1.995). Se han usado estos tres nombres, de manera intercambiable, para referirse al mismo organismo como se identifica y se describe además en la presente memoria.

L. intracellularis es una bacteria intracelular obligatoria que no puede ser cultivada por métodos bacteriológicos normales en medios convencionales, exentos de células, y se ha pensado que para crecer precisa células epiteliales unidas. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19, 4.286-4.292 (1.993) y G. Lawson et al.,

J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1.136-1.142 (1.993) discuten el cultivo de L. intracellularis usando monocapas de células epiteliales intestinales de rata IEC-18 en matraces convencionales para el cultivo de tejidos. Además, H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3.227-3.236 (1.991) discute usar monocapas de células intestinales embriónicas humanas Intestine 407 y monocapas de células de adenocarcinoma colónico de conejillo de Indias GPC-16, en matraces convencionales para el cultivo de tejidos.

En particular, se puede cultivar L. intracellularis por métodos conocidos en la técnica, preferiblemente, de acuerdo con las patentes de EE.UU. Nos. 5.714.375 y

5.885.823. Por ejemplo, se pueden inocular primero células de cultivo con un inóculo que comprenda bacterias L. intracellularis de manera que se infecten las células con las bacterias. Se pueden usar numerosas líneas celulares en la práctica de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, células epiteliales intestinales de rata IEC-18 (ATCC 1589)

, células de carcinoma epidermoide humano HEp-2 (ATCC 23), células (no especificadas) de ratón McCoys (ATCC 1696)

, células de riñón de mono verde y búfalo BGMK (Biowhittaker #71-176) y células epiteliales intestinales de animales de la especie porcina. Las células de cultivo preferidas son células HEp-2, McCoys o IEC-18.

Si se usan células de cultivo, previamente a que se inoculen, las células pueden estar en la forma de una monocapa. Para formar una monocapa, se pueden sembrar las células en matraces convencionales. Cada matraz se siembra generalmente con, entre aproximadamente 1x105 células y aproximadamente 10x105 células por matraz o frasco rotativo de 25, 75, 150, 850 cm2 mezclado con medio de crecimiento. El medio de crecimiento puede ser cualquier medio para cultivo celular que incluya una fuente de nitrógeno, factores de crecimiento necesarios para las células de cultivo elegidas y una fuente de carbono tal como glucosa o lactosa. El medio de cultivo preferido es DMEM enriquecido con F 12 de Ham con suero bovino fetal al 1-5%, aunque se pueden usar otros medios de cultivo comercialmente disponibles, con buenos resultados

El cultivo exitoso de L. intracellularis se incrementa manteniendo las células de cultivo en un estado de crecimiento constante. Por lo tanto, la monocapa de células de cultivo debería estar, en el momento de la inoculación, a confluencia de aproximadamente 20 por ciento a aproximadamente 50 por ciento. Preferiblemente, las células deberían estar a confluencia de aproximadamente 30 por ciento a aproximadamente 40 por ciento, en el momento de la inoculación, lo más preferiblemente a confluencia de aproximadamente 30 por ciento.

Alternativamente, las células, previamente a que se inoculen, se pueden cultivar en suspensión, como se describe infra. Preferiblemente, primero se cultivan las células a confluencia del 100% en la forma de una monocapa en un sistema de tipo adherente, por ejemplo, un sistema de frascos rotativos y después se transfieren a 3

3.000 litros y se cultivan en suspensión El inóculo puede ser un cultivo de L. intracellularis obtenido a partir de animal de la especie porcina u otros animales, infectados.

El inóculo puede ser un homogeneizado intestinal preparado raspando la mucosa del íleon de un animal de la especie porcina u otro animal, infectado con EPP. Cuando se prepara un homogenizado intestinal, los cortes del íleon seleccionados para el cultivo deberían mostrar lesiones graves, con gran engrosamiento del intestino. A causa de la naturaleza frágil de las bacterias, las muestras deberían ser conservadas con preferencia a -70°C lo más rápidamente posible tras la necropsia. Un antibiótico al que es resistente L. intracellularis tal como Vancomicina, Amfotericina B o miembros del grupo aminoglicósido de los antibióticos, incluyendo Gentamicina y Neomicina, por nombrar algunos, se añade preferiblemente al inóculo para suprimir la contaminación de las bacterias al tiempo que se permite el crecimiento de L. intracellularis. Tanto si el inóculo es un cultivo puro como un homogenizado intestinal, la inoculación de las células de cultivo se puede llevar a cabo por diversas técnicas conocidas en la materia, dadas las explicaciones en la presente memoria.

Después se incuban las bacterias y/o las células de cultivo inoculadas, bajo una concentración disminuida de O2 disuelto. A concentraciones de oxígeno disuelto por encima de 10%, el crecimiento de L. intracellularis es inferior al óptimo y eventualmente se produce el cese del crecimiento a concentraciones de oxígeno fuera de este intervalo. Preferiblemente, las bacterias y/o las células de cultivo inoculadas se incuban en una concentración de oxígeno disuelto en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%. Más preferiblemente, las bacterias y/o las células se incuban en una concentración de oxígeno en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 8%, siendo lo más preferido con una concentración de oxígeno de aproximadamente 0% a aproximadamente 3,0%.

También es importante para el crecimiento apropiado de L. intracellularis una concentración apropiada de dióxido de carbono. A concentraciones de dióxido de carbono superiores a 0% e inferiores a 4%, se produce un crecimiento que no es el óptimo, y eventualmente se produce el cese del crecimiento a concentraciones de dióxido de carbono fuera de este intervalo. Preferiblemente, la concentración de dióxido de carbono está en el intervalo de aproximadamente 6% a aproximadamente 10%, siendo lo más preferido con una concentración de dióxido de carbono de aproximadamente 8,8%.

Además, las células se incuban preferiblemente a una concentración de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 73% a aproximadamente 96%. Se puede usar nitrógeno en lugar de parte o todo el hidrógeno presente. Lo más preferiblemente, las células se incuban en aproximadamente 0 a aproximadamente 8,0% de O2, aproximadamente 8,8% de CO2 y aproximadamente 83,2% de H2.

Se pueden incubar las células inoculadas en un incubador de doble gas u otras cámaras de gases que contengan las concentraciones apropiadas de hidrógeno, oxígeno y dióxido de carbono...

1. Método para el diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis preclínica o clínica, que comprende las siguientes etapas:

a) detectar la unión específica de una muestra líquida a un anticuerpo de L. intracellularis, en donde los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal 301:39 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205, anticuerpo monoclonal

287:6 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203, anticuerpo monoclonal 268:29 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206, anticuerpo monoclonal 110:9 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204, anticuerpo monoclonal 113:2 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 y anticuerpo monoclonal

268:18 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No.

04092202, b) comparar el resultado obtenido en a) con un control.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que tal método es un inmunoanálisis.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que tal método es un ELISA.

4. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204 que segrega anticuerpo 110:9

5. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 que segrega anticuerpo 113:2

6. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092202 que segrega anticuerpo 268:18

7. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206 que segrega anticuerpo 268:29

8. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203 que segrega anticuerpo 287:3

9. Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205 que segrega anticuerpo 301:39