MÉTODO COLORIMÉTRICO Y REACTIVO QUE SE UTILIZA PARA EL MISMO.

Un reactivo para su uso en un análisis colorimétrico de un analito que comprende:

una oxidoreductasa; un mediador; y un reactivo colorante para producir color por reducción, siendo el reactivo colorante una sal de tetrazolio y comprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio y un complejo de rutenio, y en el que al menos un átomo coordinador de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico, y un ligando que comprende un anillo aromático

La presente invención se refiere a un método colorimétrico y a un reactivo que se utiliza para el mismo.[0002] En el campo de los exámenes clínicos o bioquímicos, se emplean los análisis colorimétricos como método para analizar componentes como la glucosa, el colesterol o similares en una muestra. Por ejemplo, un análisis colorimétrico para glucosa consiste por lo general en lo siguiente: se hace reaccionar glucosa oxidasa con glucosa (sustrato) para generar gluconolactona y peróxido de hidrógeno; y se detecta el peróxido de hidrógeno con un reactivo colorante, como por ejemplo un reactivo de Trinder, en presencia de peroxidasa. Este método, en el que se mide la concentración de un sustrato indirectamente a través de peróxido de hidrógeno, no se ha limitado solamente a la glucosa, sino que se ha utilizado también para colesterol o similares. En EP-A0100217 se describe un método similar en el que se utiliza una oxidasa para su reacción con el analito para producir un ión superóxido y, a continuación, una segunda enzima (una peroxidasa) para facilitar la reducción de un reactivo colorante, midiendo así la cantidad del superóxido producido.[0003] No obstante, el análisis colorimétrico convencional implica los siguientes problemas. En primer lugar, se requiere un tiempo para medir prolongado, ya que no se mide el analito directamente, sino indirectamente a través del peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, se tardan entre 30 y 60 segundos en medir la glucosa. En segundo lugar, resulta difícil ajustar las condiciones ya que han de estabilizarse simultáneamente dos sistemas de reacción de enzima. Finalmente, el análisis colorimétrico convencional requiere oxígeno y la falta de oxígeno puede llevar a una reacción insuficiente. [0004] En US-A-4.701.420 se describe un método alternativo en el que se miden los reductantes de analitos por transferencia de un electrón desde un ión férrico para producir iones ferrosos que forman complejo con un ligando de coordinación para producir un complejo con color. En EP 0.513.594 se describen reactivos para análisis colorimétrico de analitos que son capaces de interactuar con una enzima oxidasa o que son capaces de presentar actividad de oxidasa.[0005] Oyama y cols. (J. Electroanal Chem., 199 (1986) 467470) se describe el uso de arcillas coloidales que comprenden complejos de metales de transición para catalizar reacciones como por ejemplo reducción de peróxido de hidrógeno en las superficies de electrodo. El mecanismo de reducción de ión bromato mediante complejos de ciano(bipiridil)hierro(II) se describe en Birk y cols. (Inorganic Chemistry, Vol. 17, Nº 5, 1978).[0006] Otros métodos de análisis conocidos incluyen los métodos electroquímicos que se describen en WO 96/25514, EPA-0602488, WO 99/17715 y patente EE.UU. Nº 5.938.917. En estos métodos, se mide la transferencia de electrones empleando un electrodo, en lugar de un reactivo colorante.[0007] Teniendo todo esto en cuenta, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método colorimétrico con el que se pueda conseguir un análisis en poco tiempo obteniendo valores fiables con el análisis. [0008] Un método colorimétrico de la presente invención incluye la transferencia de un electrón desde un analito a un reactivo colorante que es una sal de tetrazolio que produce color por reducción a través de un mediador utilizando una oxidoreductasa; y la realización de un análisis cualitativo o cuantitativo del analito midiendo el color producido en el reactivo colorante. El mediador comprende al menos un complejo seleccionado entre un complejo de rutenio, un complejo de osmio y un complejo de cobre, y al menos un átomo de coordinación de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico y un ligando que comprende un anillo aromático.[0009] Este método tiene solamente una reacción de enzima. Por lo tanto, el sistema de reacción es simple y tiene una buena estabilidad. Por otra parte, el tiempo comprendido entre la reacción de enzima y la reacción de producción de color es muy corto, ya que el sistema de reacción de enzima es simple y se utiliza un mediador para reducir el reactivo colorante. Esto tiene como resultado un tiempo de medición más corto. Por ejemplo, cuando se utiliza glucosa como sustrato en un método colorimétrico según la presente invención, se puede llevar a cabo la medida en un período de tiempo corto (aproximadamente 5 segundos o menos). Por otra parte, una reacción rápida hasta que se produzca el color puede salvar la enzima, de manera que el método colorimétrico resulta ventajoso desde el punto de vista económico. Este método permite que el reactivo colorante produzca color sin depender de peróxido de hidrógeno y no requiere oxígeno, lo que asegura que se pueden obtener con el análisis valores altamente fiables. [0010] El reactivo de la presente invención se utiliza para el método colorimétrico mencionado. El reactivo incluye una oxidoreductasa, un mediador como el que se ha descrito, y un reactivo colorante que es una sal de tetrazolio para producir color por reducción. Una pieza de ensayo de la presente invención incluye este reactivo. En comparación con una pieza de ensayo convencional para análisis colorimétrico que genera peróxido de hidrógeno, la pieza de ensayo de la presente invención puede conseguir un análisis en muy poco tiempo y con valores altamente fiables del análisis.

Breve descripción de los gráficos[0011] La figura 1 es un gráfico en el que se muestra la relación entre una concentración de glucosa y la producción de color del ejemplo 1 de la presente invención, en el que [OsCl(Him)(dmpby)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (Him = imidazol; dmbpy = dimetilbipiridilo).

La figura 2 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 2 de la presente invención, en el que [OsCl(Him)(dmpby)2] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.

La figura 3 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 3 de la presente invención, en el que [Ru(NH3)6] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.

La figura 4 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 4 de la presente invención, en el que [Cu(bpy)2] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante (bpy = bipiridilo).

La figura 5 es un gráfico en el que se muestra el color producido en un reactivo colorante según el ejemplo 10 de la presente invención, en el que la glucosa es el analito, [Ru(NH3)6] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.

Las figuras 6A y 6B son gráficos en los que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 11, en el que la glucosa es el analito, los mediadores son [Cu(1,10-fenantrolina)2] y [Fe(batofenantrolina)3] respectivamente y MTT es el reactivo colorante.

Las figuras 7A y 7B son gráficos en los que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 12 de la presente invención, en el que la glucosa es el analito, los mediadores son [Fe(2,2'-bipiridilo)3] y [Fe(4,4'-diamino-2,2'-bipiridil)3] respectivamente y MTT es el reactivo colorante.

La figura 8 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 13, en el que la glucosa es el analito, [Fe(TPTZ)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (TPTZ = 2,4,6tripiridil-S-triazina).

La figura 9 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 14, en el que la glucosa es el analito [Cu(cuproína)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (cuproína = 2,2'biquinolina).

La figura 10 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 15 en el que la glucosa es el analito, [Fe(nitro-PAPS)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (nitro-PAPS = (2(5-nitro-2-piridilazo)-5-[N-n-propil-N-(3sulfopropil)amino]fenol).

La figura 11 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 16, en el que la glucosa es el analito, [Fe(1-nitroso-2naftol)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante.

La figura 12 es un gráfico en el que se muestra el coloreado según el ejemplo 17, en el que la glucosa es el analito, [Fe(ácido 2-amino-4-triazolacético)3] es...

1. Un reactivo para su uso en un análisis colorimétrico

de un analito que comprende: una oxidoreductasa; un mediador; y un reactivo colorante para producir color por reducción, siendo el reactivo colorante una sal de tetrazolio y

comprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio y un complejo de rutenio, y

en el que al menos un átomo coordinador de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico, y un ligando que comprende un anillo aromático.

2. El reactivo según la reivindicación 1, en el que se reemplaza al menos un átomo de hidrógeno que ocupa una posición distinta a la posición de coordinación del ligando por un sustituyente, y en el que el sustituyente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido y un grupo halógeno.

3. El reactivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el complejo incluye al menos dos

o más tipos de ligandos.

4. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa.

5. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sal de tetrazolio comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo nitrofenilo, un grupo tiazolilo y un grupo benzotiazolilo y preferiblemente comprende al menos un reactivo colorante seleccionado del grupo que consiste en MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)3,5-difeniltetrazolio, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, cloruro de 2,3-bis(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, perclorato de 2,3-di(4nitrofenil)tetrazolio, cloruro de 3-(3-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio y cloruro de 3-(4-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio.

6. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el analito es glucosa, colesterol, ácido úrico, ácido pirúvico, ácido láctico, creatina, o creatinina, y la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa que se corresponde a cada uno de los analitos.

7. Un método colorimétrico que comprende: la transferencia de un electrón desde un analito a un mediador mediante el uso de una oxidoreductasa; la transferencia del electrón desde el mediador a un reactivo colorante que produce color por reducción;

la realización de un análisis cuantitativo o cualitativo del analito midiendo el color producido en el reactivo colorante;

consistiendo el reactivo colorante en una sal de tetrazolio y comprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio, y un complejo de rutenio; y

en el que al menos un átomo de coordinación de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y comprendiendo el complejo al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico y un ligando que comprende un anillo aromático.

8. El método colorimétrico según la reivindicación 7, en el que está reemplazado al menos un átomo de hidrógeno que ocupa una posición distinta a la posición de coordinación del ligando por un sustituyente y

en el que el sustituyente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido y un grupo halógeno.

9. El método colorimétrico según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el complejo incluye dos o más tipos de ligandos.

10. El método colorimétrico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa.

11. El método colorimétrico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la sal de tetrazolio comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo nitrofenilo, un grupo tiazolilo y un benzotiazolilo, y comprende preferiblemente al menos un reactivo colorante seleccionado entre MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1,

WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)3,5-difeniltetrazolio, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, cloruro de 2,3-bis(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, perclorato de 2,3-di(4nitrofenil)tetrazolio, cloruro de 3-(3-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio y cloruro de 3-(4-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio.

12. El método colorimétrico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el analito es glucosa, colesterol, ácido úrico, ácido pirúvico, ácido láctico, creatina o creatinina y la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa que corresponde a cada uno de los analitos.

13. Una pieza de ensayo para análisis colorimétrico que comprende el reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

20 14. La pieza de ensayo según la reivindicación 13, que comprende además un gel inorgánico.