PROCEDIMIENTO PARA MEJORAR EL AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS PRODUCIDAS DE MANERA RECOMBINANTE.

Un procedimiento para la producción recombinante de al menos una proteína diana,

que es un factor VIII humano o una muteína con dominio B eliminado del mismo, en células de mamífero, que comprende efectuar el cultivo de células de mamífero, que son capaces de la expresión de dicha al menos una proteína diana en cultivo en suspensión, bajo condiciones libres de suero y someter una suspensión de dichas células, antes de separar la proteína de las células, a una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica seleccionada de NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, y una peptona

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de una proteína factor VIII producida cultivando células de mamífero bajo condiciones libres de suero y añadiendo una sustancia iónica al medio de cultivo antes de recoger la proteína. Sustancias iónicas adecuadas son NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada y peptona. 5

Antecedentes

La mayoría de las proteínas utilizadas para aplicaciones médicas, cosméticas o industriales se producen como proteínas recombinantes en células eucariotas o microbianas cultivadas. Para ello se inserta un gen que codifica la proteína de interés en el/las organismo/células elegido(as), el/las organismo/células que porta(n) dicho gen se cultiva(n) en un medio que comprende todos los nutrientes esenciales para permitir el crecimiento y la 10 expresión de dicho gen, dando como resultado la producción de la proteína de interés. Si las células secretan la proteína de interés en el medio, se separan entre sí las células del medio usando centrifugación o membranas de filtro. Entonces, el medio recuperado que contiene la proteína libre de células se procesa adicionalmente a través de etapas de purificación para retirar proteínas de células huésped, ADN y otros contaminantes.

En general, hay dos alternativas de producción diferentes para la recogida de proteínas producidas de 15 manera recombinante, recogida continua y por lotes. Si se aplica la recogida continua, los medios de cultivo se retiran continuamente de manera lenta del recipiente de cultivo celular durante la fase de producción y se añade simultáneamente el medio fresco. Se elige la recogida continua si las células crecen de manera lenta y/o si el procedimiento facilita una concentración celular alta o si el producto debe retirarse rápidamente del cultivo para protegerlo de la degradación. La recogida por lotes se realiza en un punto definido, en el que las células se retiran 20 en una etapa y a continuación se descargan normalmente. Técnicamente es más fácil llevar a cabo una recogida por lotes que una continua, pero el procedimiento de recogida óptimo se debe determinar en cada caso específico dependiendo del producto y del tipo de células. En algunos casos, en los que el producto no se secreta, debe destruirse la membrana celular para poder recuperar el producto. Sin embargo, se prefiere mantener la membrana celular intacta, si es posible, para poder evitar la contaminación del producto con ADN y con proteínas de células 25 huésped. La recogida continua proporciona normalmente una productividad total más alta en comparación con la recogida por lotes ya que las células pueden producir durante un periodo de tiempo mayor. Para minimizar la contaminación del producto, es preferible elegir el procedimiento de recogida que libere la menor cantidad de ADN y de proteínas de células huésped. En un modo especial de cultivo por lotes, en el que las membranas celulares se mantienen intactas, se puede lograr una mejora considerable de la productividad, si se puede reutilizar la célula. 30 Este procedimiento de recogida por lotes cíclico se puede aplicar especialmente para células de producción que crecen lentamente (valiosas).

Para obtener rendimientos altos de la proteína, es importante optimizar el procedimiento para lograr una productividad alta del producto. Los principales esfuerzos por el momento para mejorar el rendimiento de una proteína producida de manera recombinante se han centrado en la inserción molecular (vectores, potenciadores, 35 promotores, etc.) para optimizar el sistema de expresión, en las condiciones bajo las que se cultivan las células y en las etapas de purificación reales. Por ejemplo se añaden al medio estabilizadores tales como inhibidores de proteasa y se establecen los procedimientos de purificación en presencia de inhibidores de proteasa para reducir la pérdida de proteína de producto. Sin embargo, a menudo es muy difícil encontrar un inhibidor de proteasa que se pueda usar durante el cultivo, ya que los inhibidores de proteasa también tienden a inhibir el crecimiento celular y la 40 producción de proteínas. En cuanto se han retirado las células, es más fácil encontrar un inhibidor de proteasa adecuado. Esto se describe, por ejemplo, en el documento US 5.831.026, en el que se añade EDTA para inhibir las metaloproteasas. Además, hay que señalar que es necesario retirar de nuevo en algún punto del procedimiento de producción cualquier agente estabilizador añadido para obtener un producto de proteína recombinante puro. Por tanto, todavía hay una necesidad de mejorar los procedimientos existentes de producción de proteína recombinante 45 para conseguir rendimientos más altos de la proteína recombinante.

Otro problema que se encuentra especialmente al utilizar células de mamífero como huéspedes de producción es que la secreción de las proteínas producidas es bastante baja. Es evidente que los productos secretados a menudo se adhieren a la membrana celular y que esto tiene una influencia en la liberación de producto. En algunos casos, se puede inhibir el retraso mediante condiciones fisiológicas (es decir, el entorno en el que se 50 cultivan las células), mientras que en algunos casos deben aplicarse condiciones no fisiológicas. Debe evitarse la ruptura total de las células, si es posible, ya que esto libera ADN y proteínas de células huésped, que debe eliminarse después en el procedimiento de purificación.

Se sabe en la técnica que un incremento en las concentraciones de sales (por ejemplo, NaCl), junto con la adición de detergente y/o ajustando un pH específico puede liberar en algunos casos las proteínas unidas. Por 55 ejemplo, K. Berman et al., Mol. Cell Biol. Res. Com. 4, 337-344 (2001) destaca que en la producción de homólogos de p38 en células HEK293, las células se pueden estimular con sorbitol o con NaCl 0,7 M durante 10 minutos antes de la recogida. A. B. Vaandrager et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, n.º 12, pp. 7025-7029 (1996) da a conocer que el

cultivo de células HEK293 que expresan cGKII de rata da como resultado la recuperación del 90-95% del cGKII expresado, y que la enzima se puede liberar de las membranas mediante una combinación de detergente (Triton® X-100 al 1%) y sal en concentración alta (NaCl 0,5 M) pero no mediante detergente o sal en concentración alta solos. A. Denys et al., Biochem J., 336, 689-697 (1998) dan a conocer que se liberó una proteína a partir de células humanas linfocitos T usando un procedimiento de lavado que incluye NaCl 0,6 M. Sin embargo, no se pudo liberar 5 toda la proteína (70%) incluso si se eleva la concentración de NaCl hasta 1 M. Además, el pH bajo, tal como pH 4, no liberó toda la proteína unida (34%), mientras que una combinación de pH bajo y concentración de sal incrementada (NaCl 0,5 M, glicina 0,2 M, pH 4) liberó toda la proteína unida. G. Grasset al., Infection and Immunity, p. 213-228 (2004) da a conocer que en la expresión bacteriana de metaloproteinasas, el procedimiento de lavado con tampón de fuerza iónica alta (NaCl 3 M) no liberó la proteína. Sin embargo, la proteína pudo liberarse mediante 10 butanol o un detergente. C. M. Mounier et al., J. Biol. Chem. 279, No. 24, pp. 25024-25038 (2004) informa para las células HEK293 y CHO que las proteínas expresadas mediante dichas células se unieron a la superficie celular. Esto se pudo inhibir incrementando la concentración de sal (NaCl) en el intervalo de 0,12 a 1 M. A 1 M parecía que todas las proteínas se habían liberado. En un ejemplo con HEK293 las células se trataron con 1M de NaCl y la proteína liberada se incrementó tres veces. M. Fannon et al., Biochemistry 39, 1434-1445 (2000) informa de la unión de 15 proteínas a fibroblastos. Se compararon tres procedimientos de lavado diferentes, sal en concentración alta (NaCl 2 M, pH 7,4), pH bajo (acetato de sodio 20 mM, pH 4) y sal en concentración alta, pH bajo (NaCl 2 M, pH 4). Todos dos los tampones, bajo ciertas circunstancias, liberan la proteína. Sal en concentración alta y pH bajo es eficaz en todos los experimentos. M. E. Zuber et al., J. Cell Physiology, 170:217-227 (1997) informa que la unión de proteínas a la superficie de las células CHO puede inhibirse mediante tratamiento con sal en concentración alta/pH bajo (NaCl 20 2 M, pH 4). J. Norbeck et al., FEMS Microbiology Letters 137, p. 1-8 (1996) informa sobre células de levadura que se sometieron a NaCl 0,4 M durante un periodo de 1,5 h durante el crecimiento y sobre los efectos del mismo sobre la tasa de expresión de varias proteínas. Finalmente, P. M. Dey et al., Planta 202:179-187 informa del aislamiento de glucoproteínas...

1. Un procedimiento para la producción recombinante de al menos una proteína diana, que es un factor VIII humano o una muteína con dominio B eliminado del mismo, en células de mamífero, que comprende efectuar el cultivo de células de mamífero, que son capaces de la expresión de dicha al menos una proteína diana en cultivo en suspensión, bajo condiciones libres de suero y someter una suspensión de dichas células, antes de separar la 5 proteína de las células, a una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica seleccionada de NH4Acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCl, CaCl2, un aminoácido con una cadena lateral cargada, y una peptona.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ajuste de la concentración de la suspensión celular se efectúa añadiendo a la suspensión celular una composición de liberación que comprende dicha al menos una sustancia 10 iónica, añadiéndose preferiblemente la composición de liberación

(i) a la suspensión celular en forma sólida o líquida; y/o

(ii) a la suspensión celular hasta 3 días, preferiblemente de 1 a 24 h, lo más preferiblemente de 1 a 120 min antes de la separación de la proteína; y/o

(iii) a la suspensión celular durante los periodos de recogida y mientras tanto, intercambiada con condiciones 15 fisiológicas durante el cultivo continuo y la recogida de la proteína; y/o

(iv) a la suspensión celular al comienzo y manteniéndose constante durante el cultivo continuo y la recogida de la proteína; y/o

(v) directamente al caldo de cultivo o añadiéndose a las células o a una suspensión de las células aisladas a partir del caldo de cultivo; y/o 20

(vi) gradualmente hasta alcanzar la concentración final dentro de 1-2000 minutos; y/o

(vii) con una técnica de diafiltración.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que

(i) la proteína diana es una proteína factor VIII con dominio B eliminado, preferiblemente es la muteína del factor VIII que tiene la SEC ID Nº:4 ó 6; y/o 25

(ii) las células de mamífero son células aisladas o células de tejido aislado de mamíferos, preferiblemente las células de mamífero son células humanas o células de roedores, más preferiblemente son células de riñón fetal humano inmortalizadas, lo más preferiblemente se seleccionan de HEK293 (ACC CLR-1573) HEK293 T (DSM ATCC 2494), 293 H y células 293 F de 293 freestyle (Invitrogen R79007), o es una CHO, Cos, hibridoma, mieloma tal como célula NSO; y/o 30

(iii) las células de mamífero se transfectan de manera estable con un casete de expresión que porta el gen que codifica la(s) proteína(s) diana; y/o

(iv) en la(s) sustancia(s) iónica(s) el aminoácido con una cadena lateral cargada es un aminoácido básico seleccionado de arginina, histidina y lisina, y la peptona es una peptona de soja; y/o

(v) la(s) sustancia(s) iónica(s) se añade(n) hasta alcanzar el equilibrio en la proteína y la superficie celular, lo 35 suficiente para romper la unión iónica y liberar las proteínas unidas a la superficie celular sin destruir la célula; y/o

(vi) se añade(n) al menos una sustancia iónica, preferiblemente dos y lo más preferiblemente tres o más sustancias iónicas; y/o

(vii) no se añaden o se añaden sólo pequeñas cantidades de detergentes no iónicos a la suspensión y/o están presentes en la composición de liberación, preferiblemente la composición de liberación está libre de detergentes no 40 iónicos; y/o

(viii) la composición de liberación comprende además una sustancia tamponadora para estabilizar el pH, preferiblemente la sustancia tamponadora se selecciona de sustancias tamponadoras de Goods, incluyendo HEPES, MES y TRIS; y/o

(ix) el pH de la suspensión celular cuando se somete a un incremento de la concentración de al menos una 45 sustancia iónica está preferiblemente en el intervalo de estabilidad para la proteína seleccionada, para FVIII es de aproximadamente de 6,0 a 7,5; y/o

(x) recogiendo la proteína se mantiene la viabilidad de las células, y después de la recogida se reduce la concentración incrementada de manera no natural de la sustancia iónica o se transfieren las células a un medio de cultivo fresco, para permitir un procedimiento de producción cíclico continuo de la proteína usando las mismas 50 células.

(xi) la composición de liberación iónica se selecciona para contener al menos una sustancia que tenga como objetivo

estabilizar las proteínas liberadas; y/o

(xii) el cultivo bajo condiciones libres de suero se realiza bajo condiciones libres de proteína o el medio de cultivo comprende uno o más componentes de proteína, preferiblemente dichos componentes de proteína se selecciona de insulina, factor de crecimiento de insulina (IGF) y similar a insulina.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: 5

(i) se añade KCl para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M; y/o

(ii) se añade CaCl2 para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,5 M, preferiblemente desde 0,05 hasta 0,2 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de 10 aproximadamente 0,1 M; y/o

(iii) se añade lisina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

(iv) se añade arginina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,2 M, preferiblemente 15 hasta una concentración en el intervalo desde 0,2 hasta 2 M, más preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

(v) se añade histidina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos 0,01 M, preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, más preferiblemente desde 0,05 hasta 0,3 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,25 M; y/o 20

(vi) se añade una peptona para elevar su concentración en la suspensión celular hasta al menos el 0,01% (p/p), preferiblemente hasta una concentración en el intervalo desde el 0,1 hasta el 20% (p/p).

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una o más de las etapas siguientes:

(a) cultivar las células en un cultivo en suspensión en un medio de cultivo; 25

(b) separar el medio de cultivo de las células cultivadas, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células cultivadas y una fracción de medio líquido;

(c) poner en contacto o suspender la fracción de células cultivadas con una composición de liberación que comprende una concentración incrementada de manera no fisiológica de al menos una sustancia iónica tal como se define en las reivindicaciones 1 a 4; 30

(d) retirar el medio de cultivo de las células, dando como resultado dos fracciones separadas, una fracción de células y una fracción de composición de liberación;

(e) aislar la proteína recombinante de la fracción de composición de liberación; y

(f) suspender la fracción de células de (d) anterior en medio de cultivo y volver a cultivar.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que 35

(i) la separación del medio las células cultivadas en las etapas (b) y (d) se efectúa mediante centrifugación, filtración, diafiltración, filtración tangencial, filtración en línea, microfiltración, campos eléctricos, campos magnéticos y ultrafiltración; y/o

(ii) el aislamiento de la proteína del medio y su purificación se efectúa usando al menos una técnica seleccionada de cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteína, intercambio de tampón, 40 cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, medios de cromatografía de intercambio iónico/hidrófoba de modo mezclado, cromatografía de quelación, cromatografía de afinidad a carbohidratos como de afinidad a heparina o lectina, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, diálisis, diferentes agentes de precipitación tales como polietilenglicol, sulfato de amonio, etanol, adsorción de hidroxiapatita, adsorción de membrana de filtrado, ligandos acoplados a partículas magnéticas, etc.; y/o 45

(iii) el soporte usado para la purificación por cromatografía, se selecciona de resinas, partículas, perlas, membranas, fibra hueca o similar; y/o

(iv) el aislamiento de la proteína comprende una etapa de captura, en la que el producto está unido y los medios de cultivo celular y la solución de liberación se arrastran por lavado, preferiblemente la etapa de captura utiliza medios de cromatografía; y/o (v) las etapas (d) y (e) se efectúan mezclando la suspensión celular con un medio 50 cromatográfico que fija el producto y después se retiran los medios de cromatografía de la suspensión celular, usando centrifugación, filtración, filtración en línea, filtración tangencial, microfiltración, campos eléctricos, campos

magnéticos y/o ultrafiltración

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

(i) que se realiza bajo condiciones estériles; y/o

(ii) en el que el medio y/o la proteína purificada se somete a una inactivación de virus y/o una etapa de eliminación.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: 5

(i) dos o más sustancias iónicas se mezclan para formar la composición de liberación; y/o

(ii) la concentración de una mezcla de sustancias iónicas necesaria para alcanzar la liberación deseada de proteínas se determina dividiendo la cantidad teórica de sustancias iónicas, basándose en la concentración de liberación óptima para cada sustancia de liberación iónica si se usa de manera separada, por el número de sustancias; y/o

(iii) mediante una combinación de sustancias iónicas, debido a los efectos combinatorios de las diferentes sustancias 10 iónicas, se requiere una cantidad más baja de cada sustancia iónica para lograr las propiedades de liberación de proteínas de la composición y para proporcionar simultáneamente condiciones de cultivo aceptables para las células; y/o

(iv) la composición de liberación iónica se selecciona de modo que al menos un componente actúa como estabilizador para la proteína liberada que es activa antes y/o después de la separación de las proteínas y las 15 células.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la composición de liberación comprende

(i) CaCl2, preferiblemente en concentraciones en el intervalo desde 0,01 hasta 0,05 M; y/o

(i) KCl, preferiblemente en concentraciones en el intervalo desde 0,1 hasta 0,2 M; y/o

(iii) arginina, histidina o lisina, preferiblemente en una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M. 20

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la suspensión celular se procesa con un sistema de microfiltración en el que el poro en el filtro se ha elegido para retener las células y eligiendo la técnica de filtración de técnicas de filtración de flujo tangencial o en línea, y en el que la composición de liberación se aplica a las células inmediatamente o con un incremento gradual usando la técnica de diafiltración y se recupera el producto libre de células en el filtrado de dicho sistema de microfiltración. 25

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que

(i) se añade KCl para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 2 M, preferiblemente desde 0,4 hasta 1 M, lo más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M; y/o

(ii) se añade CaCl2 para elevar su concentración en la suspensión celular desde 0,05 hasta 0,2 M, preferiblemente 30 hasta una concentración de aproximadamente 0,1 M; y/o

(iii) se añade lisina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o

(iv) se añade arginina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,8 M; y/o 35

(v) se añade histidina para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,3 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,25 M; y/o

(vi) se añade una peptona para elevar su concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde el 0,1 hasta el 20% (p/p).

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se añade NaCl para 40 elevar la concentración en la suspensión celular hasta una concentración en el intervalo desde 0,4 hasta 1 M, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente 0,5 M.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que

(i) se usa una combinación de NaCl y lisina en la composición de liberación, con NaCl a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 45 0,25 M y lisina a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 1 M, preferiblemente desde 0,2 hasta 0,5 M, lo más preferiblemente aproximadamente 0,4 M; y/o

(ii) se usa una combinación de NaCl, histidina y CaCl2 en la composición de liberación, con NaCl a una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,6 M, preferiblemente desde 0,075 hasta 0,35 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 M, histidina a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,3 M, 50

preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,05 M y CaCl2 a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,25 M, preferiblemente desde 0,025 hasta 0,15 M, lo más preferiblemente a aproximadamente 0,05 M.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la composición de liberación comprende CaCl2 a una concentración en el intervalo desde 0,01 hasta 0,05 M, KCl, a una concentración en el intervalo desde 0,1 hasta 5 0,2 M y arginina, histidina o lisina a una concentración en el intervalo desde 0,05 hasta 0,2 M.