MEJORA DE TRANSPORTE UTILIZANDO AGENTES DE ALTERACIÓN DE MEMBRANA.

Una composición para mejorar el transporte a través de las membranas que contienen lípidos,

consta de: (a) un agente terapéutico o de diagnóstico; y (b) un agente que mejora el transporte por la barrera de la membrana, donde el agente de transporte es sensible al pH y es hidrofóbico a valores de pH entre 5.1 y 5.5 y el agente que mejora el transporte comprende un polímero que tiene múltiples grupos carboxílicos seleccionados del grupo consistente en: (i) un polímero poli (ácido etilacrilico) covalentemente unido al agente terapéutico o de diagnóstico; (ii) un polímero poli (ácido propilacrilico); (iii) un polímero poli (ácido bútilacrilico); o (iv) un copolímero de injerto aleatorio o copolímero bloque, donde el copolímero se compone de grupos de ácidos acrílicos y grupos de ácidos acrílicos alquilsustituidos

La presente invención está en el campo de cesión de agentes terapéuticos, y más en particular en el área de mejora de transporte o cesión de moléculas en el citosol de las células, a través de barreras celulares o capas de las células, o a través de membranas lípidas, usando agentes que potencian el transporte por barreras de membranas solos o en combinación con un estímulo y/o potenciador que modifica la estructura y/o propiedades de los agentes. 5

Específicamente, la cesión eficiente de compuestos terapéuticos y de diagnóstico a la célula es un objetivo principal de las compañías farmacéuticas. Un número de diferentes enfoques han sido utilizados para incrementar la especificad y la absorción. El más común ha sido enfocado al agente terapéutico o de diagnóstico para especificar los tipos de células por conjugación de los agentes a anticuerpos que reconocen antígenos específicamente o predominantemente asociados con las células. Otros agentes, tales como los complejos policatiónicos, liposomas y 10 complejos lípidos, han sido empleados para incrementar la absorción de los compuestos generalmente por células.

Hay varios agentes terapéuticos los cuales son sólo efectivos si son cedidos intracelularmente, incluyendo material genético y proteínas varias. La terapia génica requiere de la cesión intracelular de material genético para tratar desordenes genéticos, causar mutaciones en el material genético de varias células, tales como las células tumorales, y unirse a o interactuar con diferentes sitios en las células causando un efecto. Ejemplos de proteínas incluyen toxinas, 15 las cuales son únicamente venenosas una vez que han sido liberadas desde el endosoma en el citoplasma. Para incrementar su especificidad, han sido preparadas inmunotoxinas incluyendo la toxina conjugada a un anticuerpo que se concentra en antígenos asociados al tumor. Las inmunotoxinas han tenido limitado éxito como terapéutico, sin embargo, en parte debido a la inadecuada penetración en los nódulos del tumor y a la inefectiva cesión de la toxina en los ribosomas citosólicos. 20

0004 Es a menudo difícil la cesión de compuestos, tales como proteínas, material genético, y otros medicamentos y compuestos diagnósticos, intracelularmente porque las membranas de la célula resisten el paso de esos compuestos. Varios métodos han sido desarrollados para administrar agentes intracelularmente. Por ejemplo, el material genético ha sido administrado en células in vivo, in vitro y ex vitro usando vectores virales, complejos ADN/lípidos y liposomas. El ADN ha sido también cedido por polímeros catiónicos sintéticos y copolímeros y portadores 25 naturales catiónicos tales como quitosan. Algunas veces, los polímeros sintéticos son hidrofóbicamente modificados para potenciar la endocitosis. Mientras que los vectores virales son eficientes, las preguntas continúan con respecto a la seguridad de un vector vivo y el desarrollo de una respuesta inmune después de una administración repetida. Los complejos lípidos y liposomas parecen menos efectivos en la transferencia de ADN en el núcleo de la célula y podrían ser potencialmente destruidos por macrófagos en vivo. 30

La endocitosis mediada por receptor ofrece un medio alternativo para dirigirse a tipos de células específicas y para la cesión de agentes terapéuticos intracelularmente. La endocitosis mediada por receptor (EMR) ocurre cuando los ligandos se unen a los receptores de la superficie de la célula en membranas de células eucariotas, iniciando o acompañando una cada cascada de fenómenos en no-equilibrio, culminando en la invaginación célular de los complejos de membrana con vesículas recubiertas de clatrina. Los compuestos que interactúan con los receptores específicos de 35 la superficie de la célula son empleados para dirigirse a receptores específicos de la superficie de la célula. Los compuestos son endocitosados en los endosomas una vez que los compuestos interactúan con los receptores de la superficie de la célula. Los enlaces han sido hechos directamente con los compuestos, o en el caso del ADN, a través de la conjugación con polímeros policatiónicos tales como la polilisina y DEAE-dextrano que luego forman complejos con el ADN. Haensler et al., Bioconj. Chem., 4:372-379 (1993). 40

Incluso después de que los agentes terapéuticos son cedidos intracelularmente, el tráfico normal en la célula puede minimizar su efectividad. Por ejemplo, algunos conjugados anticuerpo-antígeno están fácilmente endocitosados. Sin embargo, después de la endocitosis, el anticuerpo no es liberado en el citosol sino que continúa aislado en endosomas hasta que es conducido a un lisosoma para degradarse. Press, O. W. et al, Cancer Research, 48: 2249-2257 (1988). Los endosomas son vesículas fosfolípidas unidas por membrana que funcionan en el tráfico intracelular y 45 degradación de proteínas internalizadas. El pH interno de los endosomas está entre 5.0 y 5.5. Una toxina conjugada con este anticuerpo estará similarmente aislada en el endosoma, y si se dirige a un lisosoma, quedará totalmente inutilizada. El material genético, estando cargado negativamente, forma a menudo un complejo con materiales policatiónicos, tales como quitosan y polilisina, para cederlo a una célula. Ambas, inmunoterapia y terapia génica usando complejos ácidos nucleicos/policatiónicos están limitadas por la circulación de los complejos en la célula desde los endosomas a los 50 lisosomas, donde los anticuerpos conjugados o los ácidos nucleicos son degradados e inutilizados.

Por consiguiente, una limitación mayor de muchas terapias potencialmente útiles es que los agentes, incluso si pueden ser captados por las células deseadas y endocitosados por las células, a menudo no son liberados efectivamente desde endosomas en el citosol, pero son degradados por los lisosomas.

Diversos métodos han sido propuestos para evitar o minimizar la degradación lisosomal de estos agentes. Un 55 método implica incluir agentes lisosomotróficos tales como cloroquina en formulaciones usadas para administrar agentes terapéuticos intracelularmente. Otro método implica alterar el endosoma de forma que el agente es cedido en el citosol antes de que sea transportado y degradado por los lisosomas. Es preferible alterar el endosoma de forma que el material nunca esté en contacto con el lisosoma. Al menos dos vías han sido elaboradas para alterar la membrana

endosomal. Un método aprovecha el pH en el interior de los endosomas, y usa materiales que son relativamente hidrofílicos a pH fisiológico (alrededor de 7.4) y relativamente hidrofóbico en el pH interno de los endosomas. Ejemplos de tales materiales son el ácido carboxílico conteniendo polímeros tales como poliácido hidrofóbico poly (ácido 2-etilacrílico) (PEAA), que están negativamente cargados a pH alcalino y sin carga en el pH interno del endosoma debido a la protonación de las fracciones de ácido carboxílico: 5

Se ha demostrado que PEAA solubiliza las membranas lípidas en una forma dependiente del pH, permeabilizando y solubilizando membranas en un pH ácido (aproximadamente 6.3), mientras que no tiene efecto en pH alcalino. Thomas, J.L et al., Biophysical Journal 67:1101-1106 (1994); Thomas, J. L. et al., Acc. Chem. Res., 25:336-342 (1992). Se ha postulado que los efectos de PEAA son debidos a su anfifilicidad más que a su estructura, consistente en un proceso de micelación conducido hidrofóbicamente. Un proceso similar ha sido hipotetizado para la interacción de 10 apolipoproteínas, melitina, y otras bases de polipéptidos anfifílicos en base a hélice α con membranas lipídicas.

Varios péptidos también alteran las membranas endosomales en forma dependiente de pH. Ejemplos de péptidos que muestran alterar liposomas, eritrocitos, y endosomas, incluyen pèptidos virales, tales como los péptidos de virus de influenza y péptidos que incluyen la secuencia de aminoácido 23 amino terminal de la hemaglutinina del virus influenza y péptidos relacionados cuyos virus desestabilizan las membranas endosomales en una manera dependiente 15 de pH tal como GALA (también conocido como EALA) que incluye la repetición de bloques de ácido glutámico alanina-leucina-alanina. Estos péptidos han sido conjugados con complejos de ADN que utilizaron un camino de endocitosis mediada por receptor para la absorción en las células de cultivo. Una fuerte correlación fue observada entre la interrupción de eritrocitos específica de pH con la transferencia de genes. Plank, C. et al., J. Biiol. Chem. 17 (269): 12918-12924 (1994); Hughes, J.A. et al., Pharm Res., 13(3):404-(1996).... [Seguir leyendo]

1. Una composición para mejorar el transporte a través de las membranas que contienen lípidos, consta de:

(a) un agente terapéutico o de diagnóstico; y

(b) un agente que mejora el transporte por la barrera de la membrana, donde el agente de transporte es sensible al pH y es hidrofóbico a valores de pH entre 5.1 y 5.5 y el agente que mejora el transporte comprende un 5 polímero que tiene múltiples grupos carboxílicos seleccionados del grupo consistente en:

(i) un polímero poli (ácido etilacrilico) covalentemente unido al agente terapéutico o de diagnóstico;

(ii) un polímero poli (ácido propilacrilico);

(iii) un polímero poli (ácido bútilacrilico); o

(iv) un copolímero de injerto aleatorio o copolímero bloque, donde el copolímero se compone de grupos de 10 ácidos acrílicos y grupos de ácidos acrílicos alquilsustituidos.

2. La composición de la reivindicación 1, donde el agente que mejora el transporte de barrera de membrana no es hidrofóbico en el rango de pH entre 6.8 y 7.5.

3. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de transporte está acoplado con un ligando que se une a la superficie de una célula. 15

4. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico es un agente citotóxico.

5. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico es seleccionado de los grupos consistentes en un nucleósido, un nucleótido, y un oligonucleótido.

6. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o de diagnóstico es seleccionado del grupo consistente en una proteína, una toxina a base de glicoproteína, y un péptido. 20

7. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o de diagnóstico es seleccionado del grupo consistente en un azúcar o un polisacárido.

8. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico es una toxina selecciónada del grupo consistente en ricina, cadena B de la toxina de difteria, péptido adenovirus, péptido de virus influenza, péptido GALA, abrina, modeccina, exotoxina de Pseudomonas, briodina, lectina de muérdago, toxina Shiga, toxina 25 Escherichia coli lábil, toxina Pertussis, toxina de cólera, toxina de ántrax, viscumina, saponina, gelonina, momordina, tricosantin y proteína antiviral Phytolacca.

9. La composición de la reivindicación 8, donde el agente terapéutico es ricina.

10. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de transporte es un polímero poli (ácido propilacrilico).

11. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o de diagnóstico es un agente 30 radioetiquetado.

12. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de diagnóstico es un agente fluorescentemente etiquetado.

13. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de diagnóstico es un agente enzimaticamente etiquetado. 35

14. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de diagnóstico es un agente de contraste.

15. La composición de la reivindicación 1, donde el polímero es un polímero de injerto o polímero bloque, donde el copolímero se compone de grupos de ácidos acrílicos y grupos ácidos acrílicos alquil sustituidos.

16. La composición de la reivindicación 1, donde el polímero es un copolímero aleatorio que contiene grupos de ácidos acrílicos y grupos de ácidos acrílicos alquilsustituidos. 40

17. La composición de la reivindicación 15 o 16, donde el polímero comprende grupos etil acrilatos, grupos propil acrilatos o grupos bútil acrilatos.

18. La composición de la reivindicación 15 o 16, donde el polímero consta de grupos ácidos acrílicos, grupos ácidos etilacrilicos, grupos ácidos propilacrilicos y grupos ácidos butilacrilicos.

19. La composición de la reivindicación 1, donde el agente de transporte contiene además un péptido, que es hidrofóbico en un rango de pH de 5.1 y 5.5.

20. La composición de la reivindicación 19, donde el péptido es seleccionado del grupo consistente en EALA, melitina, y un péptido que contiene una estructura repetitiva ácido glutamico -alanina-leucina- alanina.

21. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está 5 covalentemente acoplado al agente de transporte.

22. La composición de la reivindicación 1, donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está acoplado iónicamente al agente de transporte.

23. El uso de la composición de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en la fabricación de un medicamento para mejorar el transporte del agente terapéutico a través de membranas que contienen lípidos. 10

24. El uso de la composición de la reivindicación 23, donde la composición es para administrarse a células en una suspensión.

25. El uso de la composición de la reivindicación 23, donde la composición es para administrarse a capas de células para mejorar el transporte a través de las capas celulares.

26. El uso de la composición de la reivindicación 23, donde la composición es para administrarse a membranas de 15 los lípidos para mejorar el transporte hacia dentro y fuera de las membranas lípidicas.

27. El uso de la composición 23, donde la composición es para administrarse con un estímulo para mejorar adicionalmente el transporte del agente terapéutico o de diagnóstico a través de la membrana que contiene lípidos.

28. El uso de la reivindicación 27, donde el estímulo es seleccionado del grupo consistente en ultrasonido, campos 20 eléctricos, radiación y combinaciones de las mismas.

29. El uso de la reivindicación 28, donde el estímulo es ultrasonido.

30. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para mejorar el transporte del agente terapéutico a través de membranas que tienen lípidos.

31. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para uso en medicina. 25