MEDIO NUTRITIVO PARA EL CULTIVO DE LEVADURAS.

Se desarrolló un nuevo medio nutritivo para el cultivo de levaduras,

especialmente para el aislamiento selectivo, diferenciación eidentificación simultánea de levaduras, particularmente de especies del género Candida de interés clínico o ambiental. La esenciade la invención radica en el empleo de una combinación de extracto de boniato y extracto de levadura o de tomate para proveer elcrecimiento de diferentes especies fúngicas. Al medio nutritivo se le incorporan sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos específicos para detectar la actividad enzimática de las fosfolipasas, aminopeptidasas, hexosaminidasas y glucosidasas, y sustancias que contienen proteínas para detectar actividad proteolítica presenteen especies del género Candida. El medio contiene, además, fuentes de carbono, sales, agentes buferantes, inhibidores de las bacterias y agar. El medio nutritivo permite la diferenciación de lasespecies de Candida por la coloración de las colonias, la emisiónde fluorescencia bajo luz ultravioleta, la formación de halos yla morfología de las colonias

Objeto de la invención y estado de la técnica

La presente invención se relaciona con el campo del diagnóstico microbiológico y más específicamente con el cultivo e identificación de levaduras de importancia clínica y, en particular, de diferentes especies del género Candida.

En la patente de Estados Unidos No. 4144133, se reivindica el uso de bilis de buey, saponina purificada y un sustrato para la detección de la enzima fenol oxidasa, que posibilita la identificación de hongos patogénicos, específicamente Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Sin embargo, este método no permite el crecimiento, identificación y diferenciación de todas las especies de Candida de importancia clínica o ambiental.

Komatsu Osamu, en la patente de Japón JP2003310298, describe un método para discriminar Candida albicans y Candida tropicalis de otros hongos, utilizando el sustrato X-glc. La especificidad de este sustrato no garantiza la adecuada diferenciación de todas las especies de Candida de interés clínico y/o ambiental.

Beckford, O. A. y colaboradores, en la patente No. 4030980, describen un aparato para el aislamiento e identificación de levaduras de origen médico que comprende el uso de varias pruebas bioquímicas y medios de cultivo para la identificación de especies de Candida, entre otros microorganismos. El aparato y la técnica para su empleo presentan como inconvenientes fundamentales: la complejidad para la producción de dicho dispositivo, complejidad en la inoculación de cada uno de los pocillos y la necesidad de aislamiento de las colonias, entre otras desventajas. Las desventajas relevantes consisten en que los pocillos con las pruebas bioquímicas no contienen sustancias nutritivas suficientes ni apropiadas para el crecimiento de las especies de Candida, y la identificación se realiza teniendo en cuenta múltiples respuestas bioquímicas, por lo que una respuesta atípica en uno de los pocillos puede conllevar a una identificación errónea.

En la patente de Gran Bretaña GB 730763, se describe un medio de cultivo para el aislamiento e identificación de especies del género Candida que incluye en la formulación una sal inorgánica de bismuto y sulfito de sodio, en conjunto con un agente solidificante. También se incluyen en el medio un carbohidrato soluble, piruvato de sodio, glicina, fosfato orgánico y extracto de levadura. Este medio de cultivo posee una serie de deficiencias técnicas, específicamente:

- No posee los nutrientes necesarios para garantizar el crecimiento abundante y rápido de todas las especies de Candida de interés, ya que contiene una sola fuente de vitaminas, específicamente el extracto de levadura y cuyo contenido de minerales, en particular de magnesio, no es suficiente para activar de manera significativa el complejo sistema enzimático de estos microorganismos.

- De manera similar, el medio comprende una sola fuente de energía – piruvato de sodio – que no es suficiente para garantizar por igual el crecimiento rápido y abundante de las distintas especies de Candida.

- El medio no permite la diferenciación de las distintas especies de Candida entre ellas.

- La glicina por sí sola no es capaz de garantizar el nitrógeno suficiente para la síntesis de aminoácidos, proteínas, enzimas y, por tanto, para un crecimiento rápido y exuberante de las especies de Candida.

Jesús Ruiz-Aragón y colaboradores (Evaluación de un nuevo medio CHROMOagar Candida para la identificación presuntiva de levaduras. Revista de Diagnóstico Biológico. V.52(1), 2003), compararon el nuevo medio CHROM M con los medios CHROM O y CHROM R (Beckton Dickinson). En la tabla 1 de dicho artículo se aprecia que el CHROM O no fue capaz de diferenciar todas las especies de Candida evaluadas entre sí. En el caso de CHROM R tampoco todas las especies de interés pueden ser totalmente diferenciadas y en el medio CHROM M varias especies presentan igual o similar coloración. Los autores destacan que los resultados se aprecian mejor solo después de 48 horas de incubación. Además, concluyen que CHROM M no demostró la misma eficacia para la identificación de especies de levaduras ya que presenta menor sensibilidad, necesita mayor tiempo de incubación para que las colonias se desarrollen y dificulta la diferenciación de algunas especies de interés clínico como Candida tropicalis y Candida parapsilosis.

En la patente de Estados Unidos No. 5449612, se describe un método de identificación de cepas de Candida albicans y Torulopsis glabrata, utilizando sustratos cromogénicos de monoaminoácidos o péptidos sin necesidad de aislar la cepa a identificar. En la composición del medio se incorpora la cicloheximida para inhibir el crecimiento de algunas especies de Candida diferente a Candida albicans lo que limita las posibilidades diagnósticas de esta variante del medio. La adición de sustancias antibacterianas, tales como la gentamicina, le restan estabilidad al medio preparado y su conservación no puede ser prolongada. El cloranfenicol, además, interfiere en el desarrollo de las reacciones cromogénicas.

Además, las bases nutritivas empleadas como fuente de nitrógeno de la invención (Yeast Nitrogen Base, Neopeptone, Proteose Peptone, Bacto Peptone y Extracto de Levadura) por sí solos o en las combinaciones entre ellos no garantizan el contenido de vitaminas y minerales, macro y micro elementos, suficientes para el crecimiento temprano de todas las especies de Candida.

En la patente de Estados Unidos No. 5534415, se describe un medio selectivo y diferencial para el crecimiento y detección de Candida albicans. La esencia del medio consiste en poseer una base nutritiva metabolizada por las levaduras, un sustrato cromogénico o fluorogénico capaz de ser hidrolizado por la enzima hexosaminidasa asociada a Candida albicans y al menos un compuesto que contiene hexosaminidasa capaz de activar la enzima hexosaminidasa. Los componentes que proporcionan fuente de nitrógeno al medio son las peptonas en cantidades de 0,01 hasta 40 g/L como, por ejemplo, la peptona de carne, la peptona de soya y mezclas de peptonas, y extracto de levadura, en cantidades de 0,01 hasta 40 g/L. Estos componentes nitrogenados por sí solos no brindan todos los nutrientes ni las vitaminas necesarias para un crecimiento profuso y temprano de todas las especies de Candida y, además, no garantizan de ninguna manera reacciones cromogénicas bien definidas y de coloración intensa en las primeras horas de crecimiento de las especies de Candida.

La inclusión en la formulación de fuentes de carbono, en las concentraciones señaladas por los autores, tales como: glucosa, acetato, lactato, aminobutirato, entre otros, o sus mezclas sólo puede ser empleada en combinación con este tipo de sustrato cromogénico específico, ya que competiría con la actividad enzimática de otras especies de Candida y limita, a su vez, la posibilidad de incorporar otros sustratos cromogénicos o fluorogénicos para identificar o diferenciar otras especies de Candida. Tal es el caso de la glucosa que impediría o debilitaría la actividad de la glucosidasa. En la composición del medio se incluyen tampones tales como fosfatos, TRIS, HEPES y citratos, los cuales se encuentran en cantidades que garantizan un pH en la región cercana a 7, lo que solo favorece a Candida albicans, y no así a otras especies del género de interés sanitario o ambiental.

Otros activadores pueden ser adicionados al medio como sales de magnesio, manganeso y calcio en cantidades de 0 a 10 mMol/L.

En la formulación también se incluyen sustancias que aumentan la permeabilidad celular tales como sales biliares, desoxicolato de sodio, polioxietilenglicol y éteres de alkil fenol, sorbitán y ésteres de ácidos grasos en una concentración de 0 a 5 g/L. Algunas de estas sustancias como, por ejemplo, las sales biliares resultan en extremo inhibitorias para algunas especies de Candida, incluso para Candida albicans.

También al medio se le adiciona una mezcla de inhibidores de bacterias Gram-positivas y Gramnegativas, tales como gentamicina, penicilina, entre otros. Estas sustancias, en su mayoría, son inestables al calor y deben ser preparados y utilizados con rapidez. Además, los medios preparados, listos para el uso en placas de Petri, deben ser almacenados en refrigeración por períodos de conservación no prolongados y éstos se enmarcan entre los 2 y máximo 30 días.

Se describe la posibilidad del empleo de telurito y molibdato o sus mezclas que resultan igualmente altamente inhibitorios... [Seguir leyendo]

1. Medio nutritivo para el cultivo de levaduras caracterizado por contener una mezcla de extracto de boniato con extracto de levadura o de tomate, agar y sustancias que propician la identificación de las diferentes especies de Candida seleccionadas entre los sustratos cromogénicos y fluorogénicos, indicadores o colorantes, fuentes de carbono y sales orgánicas e inorgánicas que se encuentran en el medio nutritivo seleccionadas entre el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indoxil-Mio-Inositol-Fosfato, el Metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranósido, el 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil--D-glucopiranosido, el 6Cloro-3-Indoxil--D-glucopiranosido, la 4-Metilumbeliferil-N-acetil--D-galactosaminida, la 5-Bromo-4cloro-3-indoxil-N-acetil-beta-D-glucosaminida, L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina hidrobromuro, Lprolina paranitroanilida, púrpura de bromocresol, azul de bromotimol, leche descremada, glicerol y sulfato de magnesio.

2. Medio nutritivo para el cultivo de levaduras según la reivindicación 1 caracterizado por contener una mezcla de extracto de boniato con extracto de levadura o de tomate, en cantidad de 20 a 30 g/L, encontrándose el extracto de boniato en cantidad de 50 a 67 % con respecto a la masa de la mezcla, de 13 a 15 g/L de agar y las sustancias que propician la identificación de las diferentes especies de Candida seleccionadas entre los sustratos cromogénicos y fluorogénicos, indicadores o colorantes, fuentes de carbono y sales orgánicas e inorgánicas que se encuentran en el medio nutritivo en cantidad de 0 a 26 g/L, preferiblemente el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indoxil-Mio-Inositol-Fosfato, en cantidades de 0 a 0,1 g/L, el Metil-umbeliferil-alfa-D-glucopiranósido de 0 a 0,1 g/L, el 5-Bromo-4cloro-3-indolil-N-acetil--D-glucopiranosido de 0 a 0,1 g/L, el 6-Cloro-3-Indoxil--D-glucopiranosido de 0 a 0,1 g/L, la 4-Metilumbeliferil-N-acetil--D-galactosaminida de 0 a 0,15 g/L, la 5-Bromo-4-cloro-3indoxil-N-acetil-beta-D-glucosaminida de 0 a 0,1 g/L, L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina hidrobromuro de 0 a 0,5 g/L, L-prolina paranitroanilida de 0 a 0,2 g/L, púrpura de bromocresol de 0 a 0,04 g/L, azul de bromotimol de 0 a 0,08 g/L, leche descremada de 0 a 5 g/L, glicerol de 0 a 25 g (mL)/L y sulfato de magnesio de 0 a 0,5 g/L.

3. Medio nutritivo según la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque contiene una combinación de potenciadores de la reacción cromogénica consistente en maltosa o trehalosa.

4. Medio nutritivo según la reivindicación 3, caracterizado porque la maltosa o trehalosa se encuentra en cantidades de 1 g por cada g (mL) de glicerol.

5. Medio nutritivo según reivindicaciones de la 1-4, caracterizado porque contiene sustancias que aportan nitrógeno, específicamente aquellas seleccionadas entre la glicina, peptona bacteriológica e hidrolizado enzimático de caseína.

6. Medio nutritivo según reivindicación 5, caracterizado porque las sustancias que aportan nitrógeno, se encuentran en cantidades de 0 a 13 g/L, específicamente la glicina a concentración de 0 a 3 g/L, peptona bacteriológica de 0 a 5 g/L e hidrolizado enzimático de caseína de 0 a 5 g/L.

7. Medio nutritivo según reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque contiene inhibidores de las bacterias que son preferiblemente seleccionados entre el ácido nalidíxico, la rosa bengala, , el desoxicolato de sodio, sulfito de sodio, el citrato de amonio y bismuto y el cloruro de tetrafeniltetrazolio.

8. Medio nutritivo según la reivindicación 7, caracterizado porque los inhibidores de las bacterias se encuentran en una cantidad de 0 a 10 g/L y más específicamente el ácido nalidíxico, se adiciona en cantidad de 0 a 0,05 g/L, la rosa bengala, en cantidad de 0 a 0,05 g/L, el desoxicolato de sodio de 0 a 0,5 g/L, sulfito de sodio de 0 a 3 g/L, el citrato de amonio y bismuto de 0 a 5 g/L y el cloruro de tetrafeniltetrazolio de 0 a 0,05 g/L.

9. Medio nutritivo según las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque contiene sustancias reguladoras del pH y activadores enzimáticos, en cantidades de 0 hasta 6 g/L, preferiblemente el fosfato monopotásico, el fosfato dipotásico y el 3-Morpholino-propansulfonsaure .

10. Medio nutritivo según las reivindicación 9, caracterizado porque el fosfato monopotásico se encuentra en una cantidad de 0 a 1 g/L, el fosfato dipotásico de 0 a 4 g/L y el 3-Morpholinopropansulfonsaure (ácido 3-morpholino-propano sulfónico), también conocido MOPS, de 0 a 0,5 g/L.

11. Medio nutritivo según las reivindicaciones de 1 a la 10, caracterizado porque la totalidad de los ingredientes a utilizar, se añaden en cantidad de 35 a 50 g en 1 litro de agua destilada o desionizada con un valor de pH de 5 a 7.

12. Medio nutritivo según la reivindicación 11, caracterizado porque el pH se ajusta a valores entre 6,0 y 6,8.