Lipasa termófila.La presente invención se refiere a enzimas termófilas,

en particular a lipasas termófilas, de Thermus thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilas y su empleo en la elaboración de una composición detergente, en la modificación de grasas y aceites y en la hidrólisis de las mismas

Lipasa termófila.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a enzimas termófilas, en particular a lipasas termófilas, de Thermus thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilos.

Antecedentes de la invención

Las enzimas son catalizadores muy potentes, selectivos y muy específicos. El término lipasa es un término general para denotar una enzima que hidroliza triglicéridos.

Las aplicaciones que tienen las lipasas en la industria actual son múltiples: fabricación de detergentes, en la industria de la leche y los quesos, en panaderías para mejoramiento de sabores, en la industria de bebidas, producción de productos químicos de interés por medio de enlaces éster, polimerización e incluso, se están realizando investigaciones para la producción de biodiésel. Las lipasas están entre las enzimas más útiles en tecnología de alimentos ya que son capaces de hidrolizar grasas, transesterificar e interesterificar grasas, etc. y de este modo permiten obtener ácidos grasos o grasas y aceites de alto valor nutricional y económico.

Sin embargo, las enzimas presentan también importantes limitaciones para su aplicación industrial. Por ejemplo, que son generalmente inestables y no pueden ser utilizadas en numerosos ciclos de reacción.

El mayor requisito para una enzima comercial es su estabilidad térmica porque la desnaturalización térmica es una causa común de la inactivación enzimática. Adicionalmente, mediante el incremento en la termoestabilidad enzimática se podrían llevar a cabo reacciones enzimáticas a mayor temperatura, lo que podría ayudar para aumentar los ratios de conversión, la solubilidad del sustrato y reducir la posibilidad de crecimiento microbiano y la viscosidad en el medio de reacción. En el procesado de los alimentos, desde un punto de vista de higiene, las reacciones enzimáticas a altas temperaturas son menos peligrosas para la contaminación por bacterias. En la descomposición de grasas y aceites, actualmente se emplean métodos en los que las grasas y aceites se ponen en contacto con vapor a temperaturas de aproximadamente 250ºC y a presiones de aproximadamente 50 atmósferas, lo que implica la necesidad de disponer de instalaciones adecuadas para llevar a cabo tales reacciones. Grasas como el ácido palmítico o el ácido esteárico son sólidas a temperatura ambiente y tienen puntos de fusión de aproximadamente 65ºC. Por ello, las reacciones de hidrólisis deben llevarse a cabo a temperaturas por encima de dicho punto de fusión. Actualmente, también se están empleando lipasas en la industria del papel para evitar los depósitos de brea sobre la pasta de papel. Las enzimas convencionales se inactivan a temperaturas superiores a los 70ºC, por lo que la temperatura durante el proceso de la fabricación del papel tiene que limitarse y controlarse.

La disponibilidad de lipasas termofílicas permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas (por ejemplo, reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en agua).

Los microorganismos extremófilos han despertado un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente 5 adecuadas para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a temperaturas superiores a 45ºC, y en algunos casos (hipertermófilos) incluso por encima de 90ºC.

Aunque los organismos termófilos pueden ser buenos candidatos en producir enzimas termoestables, muchas veces no resulta práctico debido al bajo rendimiento y al equipo de fermentación de alta temperatura que sería necesario emplear.

La producción de enzimas de interés biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente con aquel del que procede la enzima de interés.

Las bacterias del género Thermus sp. se caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos termófilos extremos. Las bacterias del género Thermus sp. tienen gran potencial de utilización como sistemas de obtención de enzimas termoestables mediante selección funcional a elevadas temperaturas, existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura científica (Fridjonsson y cols., 2002. J Bacteriol. Vol. 184:3385-3391; Brouns y cols., 2005. J Biol Chem. Vol. 280:11422-31). No obstante, la aplicación de estos métodos depende de la generación de una cepa de Thermus sp. mutante que requiera de la actividad funcional de la enzima a termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos mutantes.

La solicitud de patente japonesa JP6279782 describe una lipasa termoestable. La temperatura óptima de la enzima está en un rango de 60 a 70ºC, sin embargo, la termoestabilidad de la misma no es suficiente ya que la actividad residual de la enzima tras el tratamiento a 70ºC durante 15 minutos está por debajo del 10%. Por otra parte, el documento US2006/0024789 describe una lipasa termoestable de Geobacillus. Dicha lipasa se expresa en cepas de bacterias recombinantes, tales como en E. coli. El documento US5306636 describe una lipasa termoestable de Pseudomonas que se expresa en bacterias recombinantes, tales como E. coli y Bacillus subtitis o en levaduras. El documento JP08089244 describe la preparación de una lipasa mutada de Rhizopus expresada en Saccharomyces cerevisiae con termoestabilidad mejorada.

Por otra parte, Fuciños P., et al. (J Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describen la identificación de enzimas extracelulares con actividad lipasa/esterasa producidas en cultivos de Thermus thermophilus HB27. Dichos autores describen la purificación parcial y caracterización bioquímica preliminar de las mismas a nivel de actividad y estabilidad a altas temperaturas (80-90ºC). Sin embargo, el grado de purificación de dichas enzimas es muy bajo (factor de purificación de 4 con respecto al homogeneizado celular) y por otra parte, dichos autores no describen la secuencia aminoacídica de dichas proteínas.

Por tanto, existe la necesidad de encontrar nuevas lipasas termófilas que presenten estabilidad a elevadas temperaturas y que puedan expresarse en organismos mesófilos.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad lipasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende

i) un polipéptido según la invención; y

ii) un péptido heterólogo.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína de fusión según la invención.

En otro aspecto, la invención también se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o una... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado con actividad lipasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde dicha lipasa es una lipasa termófila.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, donde dicha lipasa termófila es estable a una temperatura comprendida entre 60 y 90ºC.

4. Una proteína de fusión que comprende

i) un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

ii) al menos un péptido heterólogo.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 4, donde dicho péptido heterólogo se selecciona del grupo de un péptido señal de secreción extracelular, un péptido de purificación o una combinación de ambos.

6. Proteína de fusión según la reivindicación 5, donde dicho péptido de purificación se selecciona entre un péptido Flag o una cola de polihistidinas.

7. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7.

9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 o una construcción génica según la reivindicación 8.

10. Vector de expresión según la reivindicación 9, que comprende, además, la secuencia de nucleótidos de un promotor.

11. Vector de expresión según la reivindicación 10, donde dicho promotor es un promotor inducible o reprimible.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11, donde dicho promotor es un promotor inducible por galactosa o lactosa.

13. Vector de expresión según la reivindicación 11, donde dicho promotor es un promotor inducible por IPTG.

14. Vector de expresión según la reivindicación 11, donde dicho promotor es un promotor que se reprime en presencia de glucosa.

15. Una célula que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 o una construcción génica según la reivindicación 8 o un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.

16. Célula según la reivindicación 15, donde dicha célula se selecciona entre una bacteria y una levadura.

17. Célula según la reivindicación 16, donde dicha bacteria es Escherichia coli.

18. Célula según la reivindicación 16, donde dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis.

19. Una composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

20. Un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad lipasa o una variante funcionalmente equivalente del mismo que comprende cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, donde cuando dicho polipéptido con actividad lipasa comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de secreción extracelular, la recuperación de dicho polipéptido se realiza a partir del medio de cultivo.

22. Procedimiento según la reivindicación 20, en donde la recuperación de dicho polipéptido con actividad lipasa se realiza a partir de los extractos celulares.

23. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en la elaboración de una composición detergente.

24. Método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 con una grasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.