Un procedimiento para la transferencia de secuencias de nucleótidos y/o genes exógenos a células animales que comprende las siguientes etapas en secuencia:

- proporcionar un vector replicante episomalmente estable que comprenda al menos una región de unión a la estructura/matriz nuclear (S/MAR) y al menos un origen de replicación (ORI) vírico, procariota y/o eucariota y al menos una secuencia de nucleótidos y/o secuencia génica de interés que debe transferirse en y expresarse en el huésped; - proporcionar células germinales masculinas no humanas vivas; - incubar dichas células germinales masculinas vivas tratadas con dicho vector episomal tal como para permitir la unión del vector con las células y opcionalmente su entrada al núcleo de las células germinales masculinas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la transferencia de secuencias de ADN y/o genes exógenos en células animales no humanas, y en particular, a un procedimiento para la transferencia de secuencias de nucleótidos en células espermáticas no humanas. Además, la invención se refiere al uso de células espermáticas, así modificadas, para la fecundación de óvulos no humanos para crear animales transgénicos no humanos o individuos genéticamente modificados.

Antecedentes de la Invención

La creación de animales transgénicos no humanos o individuos genéticamente modificados, es decir, individuos cuyo genoma ha sido modificado por la introducción permanente de ADN exógeno, ha adquirido más importancia que nunca por ejemplo en estudios de regulación génica, con fines terapéuticos y para la producción de ganado. En particular, ciertos animales no humanos pueden crearse para incrementar la producción de leche, para ser resistentes a patógenos, para uso experimental en el desarrollo de fármacos novedosos o, incluso, para xenotrasplantes.

Sin embargo, hasta la fecha, la creación de tales animales es muy compleja y problemática.

El xenotrasplante, por ejemplo, pertenece a una rama particular de la biotecnología y la medicina implicada en el trasplante de células, tejido y órganos derivados de individuos que pertenecen a distintas especies. Esta rama se conoce desde hace algún tiempo pero encuentra dificultades significativas en la aplicación práctica, debido a los problemas asociados con el rechazo de los órganos trasplantados. De hecho, se sabe que el sistema inmune del organismo receptor reconoce el órgano trasplantado como extraño e inicia una serie de reacciones que conducen al llamado rechazo del órgano extraño.

El objetivo del xenotrasplante clínico podría ser el de sustituir un órgano humano enfermo con órganos de animales, en tales condiciones por las que se evite el problema del rechazo.

Con el fin de solucionar este problema, junto con los problemas asociados con la producción de animales para otros fines tales como aquellos enumerados anteriormente, se ha propuesto la creación de animales transgénicos o más bien animales que han sido modificados genéticamente, para que lleven secuencias génicas definidas normalmente no presentes en sus genomas. En otras palabras, hay un intento de insertar secuencias de ADN que codifican la expresión de proteínas que ayudan a evitar los problemas anteriormente mencionados relacionados con el rechazo, en el ADN de ciertos animales diana.

Generalmente, la técnica más comúnmente usada para la inserción de ADN exógeno en células animales consiste en la microinyección de ADN exógeno en el pronúcleo masculino de un cigoto. Esta técnica, aunque ha demostrado ser exitosa en ratones, no ha mostrado grado alguno de éxito en ganado, tal como cerdos, que son de interés significativo para xenotrasplantes y otras biotecnologías, limitando de este modo su uso general.

Lavitrano y cols. (1989, Cell 57, 717-723) han propuesto un procedimiento alternativo para la producción de animales transgénicos, conocido como “Transferencia de Genes Mediada por Espermatozoides” (SMGT) que se basa en el descubrimiento de la capacidad de las células espermáticas para unir e “internalizar” ADN exógeno (captación de ADN), transformándolas en vectores para la transmisión de no sólo su propio material genético, sino también del ADN exógeno de interés.

Ventajosamente con respecto a otras tecnologías transgénicas, el procedimiento anteriormente resumido no requiere ningún equipo caro tal como microinyectoras o micromanipuladores, no requiere ninguna operación delicada tal como microinyección y la intervención de personal técnico especializado. Además, el procedimiento de SM-GT ha mostrado por sí mismo ser generalmente efectivo para una gran variedad de animales transgénicos con porcentajes variables de genes positivamente insertados en cigotos y expresados (Lavitrano y cols., Mol Rep. and Dev. 64: 284291, 2003).

Además, la eficacia de la frecuencia de transferencia de los genes exógenos a una progenie por microinyección en algunos casos, como por ejemplo en cerdos, no ha proporcionados resultados satisfactorios. Además, se ha observado que el ADN exógeno se inserta al azar en el ADN del huésped, teniendo como resultado ocasionalmente el bloqueo o la alteración de la transcripción de un gen funcional. De hecho, la inserción de secuencias de ADN exógeno tiene lugar por recombinación con el ADN del huésped de una forma totalmente al azar, por la que puede incluso insertarse dentro de la secuencia de un gen funcional, alterando así completamente su transcripción. Es más, se ha observado que los vectores de integración para moléculas de ADN sufren el así llamado fenómeno de “silenciamiento” génico, es decir, no se ha detectado ninguna transcripción ni expresión de los genes insertados en el genoma del huésped.

En particular, en busca de obviar el problema de la transcripción alterada del ADN huésped, es necesario diseñar secuencias de ADN para inserción de vectores plasmídicos que contengan dicho ADN con mucho cuidado y, en cualquier caso, siempre hay un porcentaje significativamente alto de casos donde es imposible predecir en qué sitio en el ADN del huésped puede insertarse el ADN exógeno y las consecuencias que esto puede causar, incluso a la progenie una vez ello se les transmite.

Sumario de la invención

El problema central de la presente invención es por tanto el de proporcionar de forma general un procedimiento para la inserción de secuencias de ADN y/o de material genético exógeno en el interior de una célula huésped de forma que se eviten los inconvenientes anteriormente mencionados.

Este problema se resuelve por un procedimiento para la inserción de material genético exógeno en una célula huésped también células germinales masculinas, en una manera tal que no se interfiera en el material genético del huésped y en una manera tal que se transfiera al óvulo y a las células embrionarias que se derivan inalterado, según lo comunicado en la reivindicación principal adjunta.

Un primer objeto de la invención es por lo tanto el de proporcionar un procedimiento para la inserción segura y fiable de ADN exógeno en una célula huésped germinal masculina no humana.

Un segundo objeto de la invención es un procedimiento para la fecundación de un óvulo no humano que comprende el uso de una célula espermática obtenible según el primer objetivo de la invención.

Adicionalmente se divulga un procedimiento para la creación de individuos genéticamente modificados que comprende el procedimiento de fecundación según el segundo objeto de la invención.

Breve descripción de las figuras

Las ventajas y características adicionales de la presente invención se comprenderán mejor a partir de la descripción detallada a continuación, que se da meramente a modo de ejemplo no limitante, con referencia a las figuras adjuntas en las que:

- La figura 1 representa un esquema del plásmido pGFP-C1;

- La figura 2 representa un esquema del plásmido pTX-E20;

- La figura 3 representa un esquema del vector plasmídico episomal pEPI-eGFP;

- Las figuras 4A y 4B representan un experimento de evolución temporal de la captación de plásmidos circulares pEPI-eGFP y pGFP-C1 traducidos por traducción de mella;

- Las figuras 5A y 5B representan el resultado de la RT-PCR usando ARN de hígado, músculo y corazón de fetos;

- Las figuras 6A-6D representan análisis histológicos de tejido muscular de distintos animales;

- La figura 6E representa un histograma de la frecuencia de distribución de puntos fluorescentes en relación con un área fija escaneada y relacionada con la expresión de la proteína fluorescente variante de GFP “Aequorea Victoria” en algunas muestras;.

- Las figuras 7A y 7B representan análisis de ADN extracromosómico obtenido por extracción de Hirt (Hirt, 1967) sometido a prueba de bandas de Southern (7A) y a análisis por enzimas de restricción (7B).

Descripción detallada de la invención

La idea central de la presente invención es la de explotar las capacidades de replicación y expresión y las características de determinados vectores plasmídicos de ADN, tal... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la transferencia de secuencias de nucleótidos y/o genes exógenos a células animales que comprende las siguientes etapas en secuencia:

- proporcionar un vector replicante episomalmente estable que comprenda al menos una región de unión a la estructura/matriz nuclear (S/MAR) y al menos un origen de replicación (ORI) vírico, procariota y/o eucariota y al menos una secuencia de nucleótidos y/o secuencia génica de interés que debe transferirse en y expresarse en el huésped;

- proporcionar células germinales masculinas no humanas vivas;

- incubar dichas células germinales masculinas vivas tratadas con dicho vector episomal tal como para permitir la unión del vector con las células y opcionalmente su entrada al núcleo de las células germinales masculinas.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las regiones S/MAR son de origen mamífero, preferentemente humano, y tienen una longitud mínima de 800 pb.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la región S/MAR se selecciona entre la región 5' del gen del interferón p humano, aislada como un fragmento EcoRI/BgIII de 2,0 kb a partir del plásmido pTZ-E20 o como un fragmento S/MAR 1,7 obtenido en el sitio de polienlace.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que dicho origen se selecciona entre EBV-ORI, BPV-ORI y SV40-ORI.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector es un vector de expresión.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector comprende adicionalmente uno o más de los siguientes elementos génicos:

un promotor, un operador, un terminador y secuencias de sitios de unión a ribosomas.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector está, además, libre de cualesquiera secuencias nucleotídicas que codifiquen cualesquiera proteínas víricas, sobre todo si actúa en trans.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el vector comprende adicionalmente uno o más genes de resistencia a antibióticos.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el vector comprende adicionalmente promotores o potenciadores constitutivos, específicos de ciclo celular, específicos de tejido, metabólicamente regulados o inducibles.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el gen de interés llevado por el vector es un gen que codifica una proteína de interés terapéutico.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el vector está asociado con vectores de transfección.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el vector está incluido en un vehículo liposomal.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el vector está unido al vehículo por medio de proteínas de unión a ácidos nucleicos.

14. El procedimiento según las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el vehículo comprende polipéptidos que contienen histidina para incrementar la facilidad de entrada en la célula huésped.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el vector es el plásmido circular pEPI-1 o se selecciona entre sus derivados que comprenden pEPI-RSV, pDiMAR, pTetMAR y pMARS.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la etapa de proporcionar células germinales masculinas comprende la selección de células espermáticas, que tengan un porcentaje de motilidad total, de al menos el 70% en el momento de la recogida y la subsiguiente eliminación del fluido

seminal para mantener un porcentaje de motilidad no inferior al 65%.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la selección de las células espermáticas comprende una primera etapa de recogida de las células espermáticas del eyaculado y una segunda etapa de identificación del porcentaje de motilidad de dichas células espermáticas.

18. El procedimiento según la reivindicación 17 en el que la etapa de recogida comprende la recolección del 3040% de la segunda fracción de eyaculado en contenedores estériles, precalentados a una temperatura de 37ºC.

19. El procedimiento según las reivindicaciones 16, 17 ó 18, en el que la etapa de eliminación del fluido seminal comprende:

a)poner la muestra de eyaculado en contacto con un medio de lavado adecuado, tal como para diluir dicha muestra;

b)separar dicha muestra del medio de lavado;

c)poner de nuevo en contacto dicha muestra con dicho medio de lavado;

d)separar de nuevo la muestra del medio de lavado.

20. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que después de la etapa a) la muestra diluida se incuba durante 3-10 minutos.

21. El procedimiento según las reivindicaciones 19 ó 20, en el que la etapa b) se realiza por centrifugación a una velocidad de entre 400 g y 1000 g, a una temperatura de entre 16º y 38ºC durante un periodo de tiempo comprendido entre 3 minutos y 20 minutos.

22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en el que el medio de lavado es una composición que comprende glucosa, a una concentración de entre 56 y 69 mM, citrato de sodio a una concentración de entre 31 y 37 mM, EDTA a una concentración de entre 11 y 14 mM, ácido cítrico a una concentración de entre 14 y 17 mM y base Trizma a una concentración de entre 48 y 59 mM, siendo típicamente la osmolaridad final de entre 200 y 320 mOs y ajustándose el pH de 6,6 a 7,5.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que el medio de lavado se esteriliza y se precalienta antes de su uso.

24. El procedimiento según las reivindicaciones 22 ó 23, en el que el medio de lavado está libre de calcio.

25. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 en el que el medio de lavado comprende adicionalmente una fuente de proteína, a una concentración de entre 1 g/l y 30 g/l.

26. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en el que el pH del medio de lavado se ajusta a un valor de 6,8.

27. Un procedimiento para la incorporación de un vector plasmídico episomal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en células espermáticas no humanas que se han tratado según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, que comprende poner dicho vector en contacto con dichas células en un medio adecuado.

28. El procedimiento según la reivindicación 27, en el que al menos 1 x 106 células espermáticas/ml se incuban con de 10-2 µg a 100 µg de vector episomal en un medio según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, a una temperatura de entre 17º y 38ºC durante un periodo de tiempo de entre 30 minutos y 4 horas.

29. Un individuo genéticamente modificado no humano, cuyas células germinales y somáticas contienen un vector de expresión episomal estable, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

30. Un individuo genéticamente modificado no humano según la reivindicación 29 que es un mamífero.

31. Un individuo genéticamente modificado no humano según la reivindicación 30 que es un cerdo.