DISPOSITIVO PARA LA GENERACIÓN DE GRADIENTES DE MICRO- Y NANOFLUJOS DE FASE MÓVIL PARA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTAS PRESTACIONES.

Dispositivo para la generación de gradientes de micro- y nanoflujos de fase móvil para cromatografía líquida de altas prestaciones,

que comprende: - un generador (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) de micro- y nanoflujos de por lo menos dos fases móviles en composiciones de diferentes porcentajes, - un distribuidor de gradiente de n posiciones (16) con un puerto de entrada, un puerto de salida y n pares de puertos para un número similar de bucles de capilares (24i), pudiéndose conectar cada uno selectivamente en un extremo con el puerto de entrada y en su otro extremo al puerto de salida, a su vez conectado a un circuito analítico que comprende una columna cromatográfica (26) y un detector (36), - unos medios para controlar el generador de micro- y nanoflujos (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) para crear las diferentes composiciones de mezcla de fase móvil, - unos medios de generación de gradiente para controlar dicho distribuidor de gradiente (16), que actúa en los tiempos de implantación y de residencia del mismo, caracterizado porque comprende además: - un contador de micro- y nanoflujos (32) conectado a dicho circuito analítico (26, 36), - un desviador del flujo (28) que tiene su entrada conectada a la salida de dicho distribuidor de gradiente (16), una salida conectada a la descarga (30) y la otra salida conectada a dicho contador de micro- y nanoflujos (32), - una unidad de control (38) que comprende dichos medios de control del generador de micro- y nanoflujos (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) para crear las diferentes composiciones de mezcla de fase móvil y dichos medios de generación de gradiente para controlar dicho distribuidor de gradiente (16), así como unos medios para controlar la posición de dicho desviador del flujo (28) y unos medios para controlar la capacidad de tratamiento de dicho generador de micro- y nanoflujos sobre la base de los datos recibidos desde dicho contador de micro- y nanoflujos (32)

La presente invención se refiere a un dispositivo para la generación de gradientes de micro-y nanoflujos de fase móvil para cromatografía líquida de altas prestaciones.

Las últimas décadas han visto una miniaturización progresiva de los sistemas de cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC), en particular con respecto a los flujos de fase móvil utilizados. Esto es así porque la reducción del flujo particularmente permite limitar el consumo de disolventes tóxicos costosos, esto también resulta en una reducción en los volúmenes de inyección y por lo tanto, permite que sean procesadas cantidades se muestra muy pequeñas. Además, si se utilizan sensores sensibles a la concentración, resulta un incremento de la sensibilidad debido a la menor dilución del disolvente en la columna y una mejor relación señal -ruido.

Finalmente, las nuevas técnicas de acoplamiento de cromatografía líquida, espectrometría de masas (LC -MS) permiten trabajar a flujos inferiores a 1 µl/min, para obtener una sensibilidad más elevada y limitar los posibles riesgos de contaminación.

Sin embargo, uno de los problemas que surgen cuando se trabaja con flujos muy bajos consiste en la falta de instrumentación capaz de generar gradientes de fase móvil fiables, con únicamente un pequeño retraso y un mezclado homogéneo de disolventes. La generación de un gradiente a flujos inferiores a 1 µl/min ciertamente requiere un sistema de bombeo adecuado, capaz no sólo de mezclar cuidadosamente y homogéneamente las fases móviles, sino también transferirlas al interior de la columna de una manera reproducible y con el mínimo retraso. Sin embargo, bajo estas condiciones, la instrumentación comercialmente disponible está forzada a funcionar a su límite y por lo tanto la fiabilidad de las prestaciones a menudo es cuestionable. Además, el perfil del gradiente eficaz presenta un modelo insatisfactorio comparado con aquello establecido.

Uno de los modos más comunes de generación de gradientes de micro-y nanoflujos de fase móvil es la técnica de flujo separado que utiliza un separador insertado entre las bombas HPLC y el inyector. Esta solución está limitada por un pobre control del gradiente realmente transferido al interior de la columna y por consiguiente de una pobre de reproducibilidad. Uno de los intentos iniciales para conseguir gradientes de escala nano fue almacenar un gradiente específico en un capilar y transferirlo después al interior de la columna con una bomba de jeringa. Los inconvenientes de este sistema son una puesta en práctica pobre, una elección limitada de gradientes que se van a formar y un pobre control de la forma del gradiente.

Otro sistema conocido, conocido como el procedimiento de dilución exponencial, consiste en pasar rápidamente el flujo de fase móvil desde el eluyente débil, contenido en una cámara de mezclado, al eluyente fuerte, con la generación de un gradiente de un perfil exponencial cóncavo.

El inconveniente de este sistema es el número limitado de tipos de gradiente que se pueden generar.

Para superar este inconveniente, ya se ha propuesto llenar la cámara de mezclado con el eluyente débil y causar que el eluyente fuerte fluya de una manera programada al interior del mezclador dinámico, a fin de poder controlar la variación del gradiente con respecto al tiempo.

El inconveniente de este sistema es una pobre versatilidad de los perfiles de gradiente que se pueden conseguir.

Otro sistema conocido consiste en la generación de un gradiente de nanoflujo exponencial introduciendo en el interior de dos cámaras de mezclado sucesivas, en primer lugar, el eluyente débil y a continuación, el eluyente fuerte y entonces transportarlos al interior de la columna utilizando una bomba cada vez.

El inconveniente de esta solución conocida consiste en una selección limitada del gradiente y del perfil, además de un retraso del gradiente constante.

La patente US nº 7.135.111 describe un dispositivo de elución de gradiente de nanoflujo. Comprende una primera bomba para el mezclado de diferentes disolventes y para transportarlos, una segunda bomba para el transporte de una solución de transferencia, un inyector, una columna y un sistema de detección. Dos bucles permiten que mezclas de disolventes diferentes sean almacenadas temporalmente, siendo transferidas éstas por la primera bomba de micro flujo y a continuación, transportadas al interior de la columna de nanoflujo por la segunda bomba, mediante una modificación en las conexiones del sistema interior y de ese modo en la dirección del flujo.

La dificultad de esta solución conocida es la dificultad de distribución de la fase móvil a un flujo constante cuando se trabaja con nanolitros/minuto.

La patente US nº 7.141.161 describe una disposición de bomba de gradiente capaz de transferir eluyentes a un cromatógrafo continuamente, a intervalos específicos de tiempo y a un flujo constante del orden de nanolitros/minuto mientras se modifica la composición de dos o más eluyentes. La disposición de bomba de gradiente incluye una válvula de múltiples posiciones de diez puertos, un primer bucle conectado a una bomba isocrática y un segundo bucle, a través del cual son transferidos los eluyentes.

El inconveniente de esta solución conocida consiste en una considerable complejidad del sistema de bomba y las válvulas, haciendo particularmente difícil de automatizar la instrumentación.

A partir del documento de Cappiello A. et al. "Variable-Gradient Generators for Micro and Nano-HPLC", Anal. Chem. 2003, 75, 1173-1179 es conocido un dispositivo para la generación de gradientes de micro-y nanoflujo de fase móvil para cromatografía líquida.

La presente invención consiste en un dispositivo para la generación de gradientes de micro-y nanoflujo de fase móvil para cromatografía líquida de altas prestaciones, tal como se define y se caracteriza en la reivindicación 1.

Dos formas de realización preferidas de la presente invención se ponen de manifiesto adicionalmente a continuación en la presente memoria haciendo referencia a los dibujos adjuntos en los cuales:

la figura 1 es una vista esquemática de una primera forma de realización del dispositivo de la invención, con dos bombas HPLC convencionales conectadas a un dispositivo separador,

la figura 2 representa cinco réplicas de separación cromatografía de una mezcla de cuatro componentes a una concentración previamente determinada,

la figura 3 representa el perfil de un gradiente ajustado continuo,

la figura 4 representa tres perfiles diferentes de un gradiente desde el 0% hasta el 100% de CH3CN en H2O bajo condiciones cromatográficas particulares,

la figura 5 representa el modelo teórico esperado de los tres perfiles de la figura 4,

la figura 6 es una vista esquemática de una segunda forma de realización del dispositivo de la invención con dos bombas de jeringa HPLC para micro-y nanoflujos.

Haciendo referencia a la figura 1, la primera forma de realización del dispositivo de la invención está destinada a la generación de micro-y nanogradientes.

Comprende dos botellas 2, 4 de dos disolventes A y B; aquellas están conectadas a través de dos bombas HPLC alternativas tradicionales 6, 8 a un mezclador 10 conectado a un filtro sinterizado 12 con poros de 0,5 µm. Este filtro está conectado a la entrada de una válvula de múltiples posiciones 16 a través de un circuito separador indicado globalmente mediante 18.

Este circuito separador comprende una válvula 14 y los capilaresPEEKsil idénticos (25 o 50 µm de diámetro interior) conectados a la válvula a través de un circuito de un volumen muerto pequeño y también conectados a una descarga 22. El circuito separador 18 permite que se obtenga el flujo deseado a partir del flujo alto generado por las bombas HPLC 6, 8 en virtud de la impedancia ofrecida por los dos capilares 20, 20' y por la columna de cromatografía 26, alimentada por el dispositivo de la invención.

La válvula de múltiples posiciones 16 es un tipo tradicional, por ejemplo el modelo EMTCST6UW de Valco Instruments Co. Inc., Huston, Tejas, y está provista de catorce puertos, dos de los cuales forman la entrada y la salida, mientras los otros doce representan los puntos de conexión para seis bucles 24i, formados con tubos de PEEK (poliéter éter cetona) de 250 µm de diámetro interior,... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para la generación de gradientes de micro-y nanoflujos de fase móvil para cromatografía líquida de altas prestaciones, que comprende:

- un generador (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) de micro-y nanoflujos de por lo menos dos fases móviles en composiciones de diferentes porcentajes,

- un distribuidor de gradiente de n posiciones (16) con un puerto de entrada, un puerto de salida y n pares de puertos para un número similar de bucles de capilares (24i), pudiéndose conectar cada uno selectivamente en un extremo con el puerto de entrada y en su otro extremo al puerto de salida, a su vez conectado a un circuito analítico que comprende una columna cromatográfica (26) y un detector (36),

- unos medios para controlar el generador de micro-y nanoflujos (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) para crear las diferentes composiciones de mezcla de fase móvil,

- unos medios de generación de gradiente para controlar dicho distribuidor de gradiente (16), que actúa en los tiempos de implantación y de residencia del mismo,

caracterizado porque comprende además:

- un contador de micro-y nanoflujos (32) conectado a dicho circuito analítico (26, 36),

- un desviador del flujo (28) que tiene su entrada conectada a la salida de dicho distribuidor de gradiente (16), una salida conectada a la descarga (30) y la otra salida conectada a dicho contador de micro-y nanoflujos (32),

- una unidad de control (38) que comprende dichos medios de control del generador de micro-y nanoflujos (2, 4, 6, 8, 40, 42, 10) para crear las diferentes composiciones de mezcla de fase móvil y dichos medios de generación de gradiente para controlar dicho distribuidor de gradiente (16), así como unos medios para controlar la posición de dicho desviador del flujo (28) y unos medios para controlar la capacidad de tratamiento de dicho generador de micro-y nanoflujos sobre la base de los datos recibidos desde dicho contador de micro-y nanoflujos (32).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de micro-y nanoflujos comprende por lo menos dos botellas (2, 4) que contienen diferentes disolventes, una bomba alternativa (6, 8) asociada con cada botella, un mezclador (10) para los flujos generados por dichas bombas y un circuito separador (18).

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque el circuito separador (18) comprende una válvula (14) controlada por dicha unidad de control (38) para conmutar entre una posición de conexión de dicho circuito separador (18) y una posición que cortocircuita este último.

4. Dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho circuito separador comprende por lo menos un capilar (20, 20') conectado a dicha válvula (14) y a la descarga (22).

5. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de micro-y nanoflujos comprende por lo menos dos botellas (2, 4) que contienen diferentes disolventes, una bomba de jeringa (40, 42) asociada con cada botella y un mezclador para los micro-y nanoflujos generados por dicha bomba de jeringa.

6. Dispositivo según las reivindicaciones 2 ó 5, caracterizado porque un filtro (12) está interpuesto entre dicho mezclador (10) y dicho distribuidor de gradiente (16).

7. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho filtro (12) está fabricado en acero sinterizado con poros del orden de 0,5 µm.

8. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque n-1 bucles (241 -245) del distribuidor de gradiente (16) tienen el mismo volumen, mientras el bucle enésimo (246) tiene un volumen mayor.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, caracterizado porque n-1 bucles (241 -245) del distribuidor de gradiente (16) tienen un volumen del orden de 50 µl, mientras el bucle enésimo (246) tiene un volumen del orden de 150 µl.

10. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el distribuidor de gradiente (16) consiste en una válvula de n posiciones.