Dispositivo y procedimiento de cromatografía de afinidad bajo vacío.

Un dispositivo de preparación de muestra, que comprende:

un depósito (20) de la muestra,

un colector (12) de vacío que presenta un taladro, y

una unidad (30) de filtro, de tal manera que se establece una vía de filtración que se extiende desde el depósitode la muestra a través de dicha unidad de filtro hasta dicho colector, estando dicha unidad de filtro situadadentro de dicho taladro de dicho colector de vacío, caracterizada porque dicha unidad de filtro comprende unacámara (38) de la muestra y una cámara inferior de volumen más pequeño que dicha cámara (38) de lamuestra y que contiene el medio (45) de cromatografía, estando dicha cámara (38) de la muestra dispuestaaguas arriba, con respecto a la dirección de flujo de fluido de dicho medio de cromatografía, teniendo dichacámara de la muestra un volumen más pequeño que dicho depósito de la muestra, de forma que dichodepósito y colector están encajados de forma estanca.

Dispositivo y procedimiento de cromatografía de afinidad bajo vacío Antecedentes de la invención Se han desarrollado numerosos dispositivos de laboratorio para llevar a cabo la filtración, la cromatografía y la centrifugación con el fin de concentrar, separar y / o purificar muestras de laboratorio.

Los investigadores necesitan con carácter rutinario concentrar su muestra antes de llevar a cabo cualquier otra labor de investigación. Hay dos enfoques fundamentales para la concentración de muestras: la captura específica, (resina cromatográfica y afinidad química) o filtros de exclusión por tamaños.

Para los investigadores que utilizan los filtros de exclusión por tamaños, existen limitaciones a las que deben adaptarse en su trabajo. El formato de estos dispositivos pueden ser o bien filtros centrífugos para un volumen de pequeñas muestras, o bien sistemas de separación de flujo tangencial a escala preparativa. Los sistemas de preparación típicamente incluyen bombas y calibradores y requieren que el usuario esté adiestrado y vigilar el proceso durante la separación. Una limitación adicional de los sistemas preparatorios es que el volumen final del concentrado puede ser mayor (50 ml o más) . Teniendo en cuenta que la muestra de partida del investigador puede ser de 250 a 1000 ml, un concentrado de 50 ml es un factor de concentración bajo. Los dispositivos centrífugos son de pequeña escala y la muestra que puede procesar de forma conveniente, es pequeña (menos de 100 ml) debido a las limitaciones de tamaño del rotor centrífugo. Los dispositivos centrífugos pueden conseguir factores de concentración muy elevados. 100x no es inhabitual, pero el volumen de inicio pequeño requeriría que la investigación efectuara una vigilancia de la separación y rellenara repetidamente la unidad de filtro para concentrar toda la muestra de partida.

En algunos casos, el dispositivo centrífugo está preparado con una columna empaquetada de medios de separación, cromatografía o afinidad. Estos dispositivos se resienten de manera similar de las limitaciones de volumen iniciales y requieren llenados repetidos para concentrar las muestras mayores de 100 ml.

La misma limitación para el proceso UF se aplica a los sistemas de medios de cromatografía de escala preparativa, en los cuales se requieren bombas y calibradores de elevado coste y operarios adiestrados y los volúmenes del concentrado final son mayores de lo que se desea.

Otro sistema de bajo coste para sistemas de captación específica es utilizar columnas de gravedad. Cuando se utilizan estos sistemas, el investigador tiene que montar el sistema para conseguir una presión de descarga suficiente para procesar la muestra a través de la columna. Esto se consigue mediante la colocación de la muestra que debe ser procesada en un tanque y situándola por encima de la columna de separación. Se utilizan tubos y conectores para ensamblar la configuración de gravedad típica. Estos montajes pueden ser poco costosos de desarrollar, pero una limitación importante es el tiempo de procesamiento que puede ser lo suficientemente largo como para requerir que el proceso se lleve a cabo en una cámara fría para proteger la muestra de la degradación térmica.

La Patente estadounidense No. 4, 755, 301 divulga un procedimiento y un aparato centrífugos para la concentración de macromoléculas sin que exista filtrado hasta que se produzca la sequedad. Una membrana de ultrafiltración semipermeable separa un depósito de la muestra de una copa de filtrado, y unos conductos de filtrado situados por debajo de la membrana están separados lo suficientemente hacia dentro respecto del borde de la membrana para que, cuando el aparato se utiliza en un rotor centrífugo de ángulo fijo, la filtración se detiene una vez que el menisco de retención alcance el nivel radial centrífugo del borde más exterior del conducto de filtrado más exterior.

El documento US 2002/0110495 A1 divulga un dispositivo de preparación de muestra que comprende un depósito de la muestra o un soporte 22 de la muestra situado por encima de un módulo 5 de columna. El módulo de columna comprende un tubo en el que es situada una cantidad del medio 60 cromatográfico. Una vía de circulación de la muestra es suministrada desde el soporte 22 de la muestra a través del módulo 5 de columna y a través de los medios cromatográficos. El módulo de columna está situado en la parte inferior del depósito de la muestra, no dentro del taladro de un colector de vacío.

Los dispositivos de preparación de muestra convencionales están limitados a volúmenes de muestra relativamente pequeños, generalmente de cerca de 0, 5 a 80 mililitros.

A estos dispositivos se les han añadido un medio de cromatografía, típicamente mediante la retirada de la membrana y sustituyéndola por un filtro o frita más abiertamente poroso y añadiendo el medio de cromatografía aguas arriba de ese filtro. En algunos casos, una capa o frita superior puede ser utilizada para mantener el medio dentro del tubo durante su almacenaje y manipulación. Una pequeña muestra que contiene una mezcla de componentes que incluyen el componente deseado (generalmente un péptido o proteína) se añade al depósito de la muestra y el dispositivo es a continuación centrifugado. El componente deseado típicamente se une (es capturado) al medio seleccionado y a todo el material restante y el fluido pasa a través del dispositivo hasta el depósito de filtrado. El dispositivo es retirado, el filtrado o bien desechado o utilizado en otras pruebas y una solución de lavado

es añadida al dispositivo que retira cualquier material suelto que puede haber sido atrapado entre el medio o abandonado sobre la superficie cuando el nivel del fluido se redujo. Este dispositivo es retirado, el filtrado es desechado (generalmente se fija una nueva copa de filtrado) y un fluido de elusión (típicamente un tampón con una resistencia al pH o iónica diferente que provoca que el componente deseado ligado se libere del medio) es añadido y centrifugado a través del dispositivo dentro de la centrifugadora. El eluyente de la copa de filtrado es recogido dado que contiene el componente deseado liberado.

Un problema de este tipo de dispositivo es que el volumen que puede ser filtrado está limitado por el dispositivo que puede acoplarse dentro de la centrifugadora. Para filtrar / capturar una muestra grande, como por ejemplo un litro de suero o de cultivo de tejido, se necesita llevar a cabo el proceso expuesto (al menos la etapa de unión y a menudo la etapa de lavado) múltiples veces.

Una alternativa es utilizar una cromatografía en columna, como por ejemplo una escala experimental o una columna preparatoria para procesar el volumen más elevado. Dichos dispositivos son costosos, y requieren columnas, soportes, bombas y la muestra y el filtrado, tanques de lavado y de eluyente. Así mismo, muchas de estas columnas están pre-empaquetadas con medios seleccionados, limitando las posibilidades de elección de los medios disponibles. Así mismo la capacidad de los medios utilizados en dichas columnas es típicamente mucho mayor de lo que es necesario para la cantidad de material necesario para ser capturado. Esto significa que a menudo se derrocha la capacidad suplementaria inherente a la columna lo que es un expediente costoso. Como alternativa, se puede limpiar y apartar la columna y utilizarla una segunda vez. Esto implica una cantidad importante de esfuerzo para asegurar que el medio está completamente limpio de manera que no quede ningún material residual (deseado o contaminante) procedente de la última prueba que pudiera afectar de manera negativa a los resultados del uso siguiente de la columna. Así mismo, la mayoría de los medios necesitan ser mantenidos refrigerados para que no resulten contaminados durante su almacenamiento.

Sería deseable contar con un dispositivo y un procedimiento para separaciones o purificaciones rápidas de alta calidad de muestras de una manera cómoda y fiable, que pudiera manejar volúmenes de muestra considerablemente más elevadas que las manejadas mediante dispositivos de centrifugación convencionales y que utilizara de manera eficaz la cantidad correcta de medios y eliminara la necesidad del derroche y del almacenamiento de las columnas entre las pruebas.

Constituye, por tanto, un objeto de la presente invención proporcionar un dispositivo de preparación de muestra que pueda procesar de manera práctica y rápida volúmenes relativamente amplios de muestra, en particular en una sola pasada con excelente captura.

Constituye otro objeto de la presente invención proporcionar un dispositivo de preparación de muestras que pueda procesar de manera rápida y práctica volúmenes relativamente... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de preparación de muestra, que comprende:

un depósito (20) de la muestra, un colector (12) de vacío que presenta un taladro, y

una unidad (30) de filtro, de tal manera que se establece una vía de filtración que se extiende desde el depósito de la muestra a través de dicha unidad de filtro hasta dicho colector, estando dicha unidad de filtro situada dentro de dicho taladro de dicho colector de vacío, caracterizada porque dicha unidad de filtro comprende una cámara (38) de la muestra y una cámara inferior de volumen más pequeño que dicha cámara (38) de la muestra y que contiene el medio (45) de cromatografía, estando dicha cámara (38) de la muestra dispuesta aguas arriba, con respecto a la dirección de flujo de fluido de dicho medio de cromatografía, teniendo dicha cámara de la muestra un volumen más pequeño que dicho depósito de la muestra, de forma que dicho depósito y colector están encajados de forma estanca.

2. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que la unidad de filtro es una carcasa de una pieza fabricada a partir de un material plástico.

3. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que la unidad de filtro es recibida de manera deslizable dentro del taladro del colector.

4. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que dicha unidad de filtro amovible de dicho colector.

5. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que dicho depósito de la muestra tiene un volumen de al menos 500 mililitros.

6. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que dicha unidad de filtro está situada dentro de dicho taladro aguas abajo de dicho depósito de la muestra, y el dispositivo comprende así mismo, una unidad (60) de filtración centrífuga situada dentro de dicho taladro aguas abajo de dicha unidad de filtro, o dicho taladro existente en dicho colector está adaptado para estar en comunicación con la fuente de vacío.

7. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que dicho medio de cromatografía es seleccionado entre el grupo que cosiste en estructuras funcionales de material compuesto, que comprenden partículas de resinas derivadas de grupos funcionales y medios a base de sílice, o en el que dicho medio de cromatografía es seleccionado entre el grupo que consiste en estructuras funcionales de material compuesto, que comprenden una o más capas de membranas derivadas de grupos funcionales o de estructuras de membrana de material compuesto que contienen medios a base de sílice.

8. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, en el que dicho depósito de muestra comprende un filtro (31) .

9. El dispositivo de preparación de muestra de la reivindicación 1, que comprende así mismo una fuente de vacío, y en el que dicho colector es un recipiente de recogida de filtrado en comunicación con dicha fuente de vacío y dicha unidad de filtro.

10. Un procedimiento de purificación de una muestra que utiliza el dispositivo de preparación de la muestra de la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:

la Introducción de dicha muestra dentro de dicho depósito de la muestra;

la extracción de dicha muestra a través de dicho depósito de la muestra hasta el interior de dicha unidad de filtro mediante la aplicación de vacío procedente de una fuente de vacío en comunicación con dicho colector para unir las moléculas de interés a dicho medio de cromatografía;

la retirada de dicha unidad de filtro de dicho colector; y

la elusión de dichas moléculas de interés de dicho medio de cromatografía.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende así mismo, el tratamiento adicional de dichas moléculas de interés eluídas mediante centrifugación.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, así mismo caracterizado por la introducción de una unidad (60) de filtro centrífuga en comunicación de fluido con dicho colector aguas abajo de

dicha primera unidad de filtro; la elusión de dichas moléculas de interés de dicho medio de cromatografía dentro de dicha unidad de filtro centrífuga; la retirada de dicha unidad de filtro centrífuga de dicho colector; y la centrifugación de dicha unidad de filtro centrífuga.