Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina,

en el que se mide la cantidad del fragmento de 22 kDa de la agrina en una muestra tomada de un paciente, y se usa la cantidad medida del fragmento de 22 kDa de la agrina en la muestra para calcular la actividad de la neurotripsina, siendo la muestra sangre u orina

Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, uso del procedimiento y uso del fragmento C-terminal de 22 kDa de la agrina como biomarcador en el diagnóstico y el control de trastornos relacionados con la neurotripsina.

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, al uso de dicho procedimiento y al uso del fragmento C-terminal de 22 kDa de la agrina como biomarcador en diferentes aplicaciones diagnósticas o clínicas, todas directa o indirectamente relacionadas con la actividad de la enzima neurotripsina.

Los biomarcadores informan sobre fenómenos biológicos en curso durante una enfermedad o tratamiento. Un biomarcador se define como cualquier característica que puede ser medida y evaluada objetivamente como indicador de un proceso biológico normal o patológico o de una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica. Distintos tipos de biomarcadores informan sobre características moleculares, parámetros fisiológicos (por ejemplo, presión arterial, frecuencia cardiaca), o proporcionan información a través de imágenes. Importantemente, proporcionan información sobre una "consecuencia": por ejemplo, sobre el resultado de un mecanismo molecular, celular o fisiológico, sobre un beneficio terapéutico o sobre el riesgo de una intervención terapéutica. Los biomarcadores útiles deberían satisfacer dos criterios, deben estar asociados con los mecanismos biológicos en curso durante una enfermedad o tratamiento, y se deben correlacionar estadísticamente con las consecuencias clínicas.

La neurotripsina es una serina proteasa de tipo tripsina. Muestra una composición de dominio única (Proba y col., 1998). Está formada por un segmento básico rico en prolina, un dominio kringle, cuatro dominios tipo secuestrante ricos en cisteína (scavenger receptor cysteine-rich, SRCR), y un dominio de proteasa.

La neurotripsina se expresa predominantemente en las neuronas de la corteza cerebral, el hipocampo y la amígdala (Gschwend y col., 1997). Mediante inmunoelectromicroscopía se localizó la neurotripsina en la membrana presináptica y la zona presináptica activa tanto de las sinapsis asimétricas (excitatorias) como de las sinapsis simétricas (inhibidoras) (Molinari y col., 2002).

La neurotripsina juega un importante papel en los trastornos neuropsiquiátricos, así como en trastornos fuera del sistema nervioso.

Recientemente se identificó la neurotripsina como una causa de una forma autosómica recesiva grave de retraso mental (Molinari y col., 2002). Los individuos que padecen retraso mental dependiente de neurotripsina muestran una delección de 4 pb en el 7º exón del gen de la neurotripsina, que da como resultado una proteína más corta que carece de dominio catalítico. El fenotipo fisiopatológico y la edad de aparición de la enfermedad en los individuos afectados caracteriza a la neurotripsina como un regulador de las funciones sinápticas de adaptación, tal como la reorganización de las sinapsis durante las etapas tardías del neurodesarrollo y la plasticidad sináptica del adulto. Tras un desarrollo psicomotor normal en los primeros 18 meses, los individuos afectados mostraban los primeros signos de retraso mental cuando tenían alrededor de 2 años de edad. Esto indica que la función de la neurotripsina es crucial en las etapas tardías del desarrollo cerebral, como por ejemplo para las funciones sinápticas de adaptación requeridas para establecer y/o mantener las funciones cognitivas superiores.

En el documento WO2006/103261 se muestra que la sobreexpresión de la neurotripsina en motoneuronas de ratones transgénicos da como resultado una degeneración de la unión neuromuscular, que a su vez provoca la muerte de las fibras musculares desnervadas. La pérdida de fibra muscular es característica del tipo de atrofia muscular encontrada en los ancianos humanos, denominada sarcopenia. Por lo tanto, se ha postulado que la inhibición de la neurotripsina podría tener un efecto beneficioso sobre la desnervación de la fibra muscular dependiente de la edad, la pérdida de fibra muscular y la atrofia musculoesquelética.

Datos adicionales (Aimes y col., 2005) sugieren un potencial papel de las serina proteasas, como la neurotripsina, en la función vascular y la angiogénesis.

En vista del papel central de la neurotripsina en el metabolismo, es deseable determinar y controlar las alteraciones relacionadas con la neurotripsina en pacientes, o evaluar el efecto de los medicamentos sobre el estado de la neurotripsina in vivo, respectivamente.

Resumen de la invención

Los inventores han averiguado que el objeto de la invención puede realizarse mediante un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se mide el fragmento de 22 kDa de la agrina en sangre u orina con objeto de determinar la actividad in vivo de la neurotripsina, y mediante el uso de dicho procedimiento según la reivindicación 3 para el diagnóstico y el control de las alteraciones relacionadas con la neurotripsina. La invención cubre adicionalmente el uso del fragmento de 22 kDa de la agrina como biomarcador especial según la reivindicación 8.

Una reivindicación independiente adicional está dirigida al uso del fragmento de 22 kDa de la agrina como biomarcador en estudios clínicos o preclínicos para establecer el efecto de las sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.

Las formas de realización preferidas de la invención se abordan en las reivindicaciones secundarias.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la secuencia proteica de la agrina humana (ID. SEC. Nº: 1). La longitud completa del precursor sin procesar es de 2.045 aminoácidos. En la porción de secuencia mostrada están marcadas las posiciones de los sitios de escisión α y β. Adicionalmente se marcan algunas subsecuencias mencionadas en los ejemplos. La secuencia del fragmento de 22 kDa de la agrina se muestra en negrita.

La Fig. 2A es una representación esquemática de la organización del dominio de la agrina y la localización de sus sitios de escisión dependientes de neurotripsina. La agrina tiene una masa proteica nuclear de aproximadamente 220 kDa. Es una proteína multidominio formada por 9 dominios FS (de tipo folistatina, follistatin-like), 2 dominios LE (de tipo laminina-EGF, laminin-EGF-like), un dominio SEA (enterocinasa de proteína de esperma y agrina, sperm protein enterokinase and agrin), 4 dominios EG (de tipo factor de crecimiento epidérmico, epidermal growth factor-like) y 3 dominios LG (globulares de laminina, laminin globular). A ambos lados del dominio SEA se encuentra una región SIT (rica en serina/treonina, serine/threonine-rich).

La agrina existe en varias isoformas, por ejemplo, una isoforma es secretada con un dominio de agrina N-terminal (NtA) y un tipo de isoforma H transmembranal con un segmento transmembranal N-terminal (TM) que asegura su anclaje en la membrana plasmática. Variantes de corte y empalme de la fracción C-terminal: un inserto de 4 aminoácidos en el sitio A/y, y los tres diferentes insertos en el sitio B/z formado por 8, 11 ó 19 (8+11) aminoácidos. La neurotripsina escinde la agrina en dos sitios. Un sitio (denominado sitio α) está localizado entre la arginina 1102 (R1102) y la alanina 1103 (A1103). El otro sitio (denominado sitio β) está localizado entre la lisina 1859 (K1859) y la serina 1860 (S1860). Los números de aminoácidos se refieren a la agrina secretada (variante de corte y empalme A0B0) del ortólogo humano (UniProtKB/Swiss-Prot O00468). De nuevo, la escisión por la neurotripsina genera un fragmento N-terminal en los intervalos de 110-400 kDa (debido a niveles diferenciales de carbohidratos), un fragmento intermedio de aproximadamente 90 kDa y un fragmento C-terminal de 22 kDa.

La Fig. 2B muestra cómo la neurotripsina escinde la agrina in vitro. Análisis por inmunotransferencia Western de células HeLa transfectadas simultáneamene con combinaciones de agrina unida membrana (+), neurotripsina natural (wt), neurotripsina inactiva (S/A), y pcDNA3.1 vacío (-). Se analizaron los sobrenadantes (S) y los lisados celulares (cell lysates, CL) con anticuerpos anti-agrina dirigidos contra el C-terminal de la agrina. Panel superior: la transfección de la agrina sola dio como resultado una señal por encima de 250 kDa en el lisado celular. Tras la transfección...

1. Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, en el que se mide la cantidad del fragmento de 22 kDa de la agrina en una muestra tomada de un paciente, y se usa la cantidad medida del fragmento de 22 kDa de la agrina en la muestra para calcular la actividad de la neurotripsina, siendo la muestra sangre u orina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se usa un fragmento de 22 kDa de la agrina preparado mediante técnicas recombinantes, como referencia.

3. Uso del procedimiento según la reivindicación 1 para el diagnóstico y el control de trastornos relacionados con la neurotripsina.

4. Uso según la reivindicación 3 para el diagnóstico y el control de enfermedades causadas por la desregulación de la neurotripsina.

5. Uso según la reivindicación 3 ó 4 para el diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados con la neurotripsina del sistema neural y neuromuscular.

6. Uso según la reivindicación 3 ó 4 para el diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados con la neurotripsina de sistemas no neurales, especialmente el riñón y el pulmón.

7. Uso del procedimiento según la reivindicación 1 en estudios clínicos o preclínicos para establecer el efecto de sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.

8. Uso del fragmento de 22 kDa de la agrina, detectado en sangre u orina en una muestra tomada de un paciente, como biomarcador para trastornos relacionados con la neurotripsina.

9. Uso según la reivindicación 8 para el diagnóstico y el control de enfermedades causadas por la desregulación de la neurotripsina.

10. Uso según la reivindicación 8 ó 9 para el diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados con la neurotripsina del sistema neuronal y neuromuscular.

11. Uso según la reivindicación 8 ó 9 para el diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados con la neurotripsina de sistemas no neurales.

12. Uso del fragmento de 22 kDa de la agrina, detectado en sangre u orina en una muestra tomada de un paciente, como biomarcador en estudios clínicos o preclínicos para establecer el efecto de sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.