INMUNÓGENOS, ANTICUERPOS Y CONJUGADOS PARA CETAMINA Y SUS METABOLITOS.

Un inmunógeno para uso en la elevación de anticuerpos para detectar cetamina y norcetamina,

comprendiendo el inmunógeno un hapteno de la norcetamina con derivación en el nitrógeno de la norcetamina; en el cual el hapteno de la norcetamina tiene la siguiente fórmula estructural: en la cual R se selecciona del grupo que incluye una unidad estructural de alquileno de cadena recta o ramificada, sustituida o no sustituida, saturada o insaturada; y X se selecciona del grupo que incluye un ácido carboxílico o un éster del mismo; una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un éster del mismo, un aldehído, una unidad estructural de ditiopiridilo, una unidad estructural de vinilsulfona o un ácido tiocarboxílico o un éster del mismo y el hapteno está acoplado a un material portador que confiere antigenicidad

La presente invención se relaciona con inmunógenos, anticuerpos y conjugados, para uso en inmunoensayos competitivos para la detección de cetamina [(±)-2-(o-clorofenil)-2-(metilamino) ciclohexanona] y su metabolito primario, norcetamina.

La presente invención también se relaciona con un método y un kit para detectar y determinar cetamina y norcetamina.

Por "detectar" se entiende analizar cuantitativamente la presencia o la ausencia de una sustancia.

Por "determinar" se entiende analizar cuantitativamente la cantidad de una sustancia.

La cetamina (ver la Figura 1 de los dibujos acompañantes) es un agente anestésico parenteral de corta duración que ha estado en uso clínico durante 30 años. El medicamento causa una analgesia profunda con dosis subanestésicas y carece de los efectos de depresión cardiorrespiratoria asociados con la mayoría de los otros anestésicos generales. A pesar de estas importantes ventajas clínicas, sin embargo, reacciones perturbadoras de emergencia, incluido delirio y sueño no placentero, frecuentemente acompañan la terapia con cetamina y limitan su utilidad clínica. Aunque el origen de estos efectos secundarios adversos del sistema nervioso central (CNS) permanecen sin dilucidar, se ha especulado que los metabolitos de la cetamina pueden jugar un papel importante ya que las concentraciones que circulan del medicamento original son muy bajas durante una emergencia de anestesia inducida por cetamina. La cetamina experimenta un gran metabolismo por parte de las enzimas hepáticas, produciendo principalmente, por N-desmetilación, norcetamina (ver la Figura 1 de los dibujos acompañantes). Esta amina primaria es metabolizada adicionalmente por hidroxilación del sistema anular del ciclohexano en las posiciones 4, 5 y/o 6 para producir una familia de norcetaminas hidroxiladas, cuyo miembro predominante es 6hidroxinorcetamina (ver la Figura 1 de los dibujos acompañantes).

Estado del arte

Hasta el día de hoy, la determinación de cetamina y sus metabolitos en fluidos biológicos se ha basado principalmente en espectrometría de masas - cromatografía de gases (GC - MS) y HPLC. Estos métodos cromatográficos proveen una excelente sensibilidad y selectividad pero requieren de la derivatización de la cetamina y sus metabolitos. Estos métodos son, además, muy costosos y consumen mucho tiempo para ser utilizados como herramientas de evaluación.

Se han utilizado extensamente reacciones específicas de enlazamiento, tales como interacciones anticuerpoantígeno, en inmunoensayos para detectar una variedad de sustancias presentes en fluidos biológicos.

Así, por ejemplo, podrían utilizarse radioinmunoensayos para la determinación de cetamina y sus metabolitos. Los radioinmunoensayos son muy sensibles, pero requieren de trazadores radionúclidos, por ejemplo 125I y 3H, y en algunos casos, una etapa preliminar de extracción. No se conocen RIA para la cetamina.

Los ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (los ELISA) son una alternativa no radioactiva que podría ser utilizada para la determinación cualitativa y cuantitativa de cetamina y sus metabolitos. Nuevamente, no se conocían los ELISA para cetamina cuando la Solicitud de Patente Europea No. 02075445.3 que constituye prioridad fue presentada el 31 de enero de 2002. Desde entonces, Neogen Corporation lanzó un kit de ELISA para cetamina con una reactividad cruzada del 100% con cetamina y una reactividad cruzada del 4,6% con norcetamina. Se cree que el kit de Neogen utiliza anticuerpos y conjugados desarrollados contra un hapteno de cetamina que incorpora al menos al epítopo metilamino de cetamina.

EP 0 459 387 A2 (Abbott Laboratories) describe un ensayo de polarización de fluorescencia para fenciclidina y ciertos derivados de fenciclidina. Los derivados de fenilciclohexilamina se conjugan con materiales portadores para producir inmunógenos y con derivados de fluoresceína para producir trazadores. Se generan anticuerpos, preferiblemente monoclonales, con los inmunógenos. Se desarrolla un inmunoensayo para fenciclidina y derivados de fenciclidina empleando los trazadores y anticuerpos anteriormente mencionados. Este inmunoensayo exhibe un alto grado de especificidad con fenciclidina, metabolitos de fenciclidina y análogos de fenciclidina. No reacciona significativamente en forma cruzada con cetamina (ver la Tabla 3(c) en la página 18). Aunque los derivados de fenilciclohexilamina exhiben similitud estructural con los haptenos de la presente invención, la ausencia de un grupo cloro sobre el anillo de fenilo y de un grupo carbonilo sobre el anillo de ciclohexilo son ambos significativos, como se corrobora por la carencia de reactividad cruzada del inmunoensayo de Abbott con cetamina. Owens et al: (‘Antibodies against arylcyclohexylamines y their similarities in binding specificity with the fenciclidina receptor' (J. Pharmacol. Exp. Ther. (1988), 246(2), 472 - 478)) describe anticuerpos contra cinco epítopos de moléculas del tipo fenciclidina (PCP), para determinar los requerimientos moleculares del enlazamiento de arilciclohexilamina con el receptor de PCP. Se sintetizan cuatro haptenos a partir de derivados de PCP y el análogo de TCP, es decir PCHP; PCHBA; tPPC y TCHP. El quinto hapteno se elabora a partir de fenilciclohexilamina: PCHAP. Estos haptenos se conjugan con BSA para producir inmunógenos que son utilizados para generar anticuerpos de reactividad cruzada. Los anticuerpos producidos son altamente específicos para PCP y algunos compuestos relacionados pero exhiben reactividad cruzada muy baja con cetamina (<0.6%) (Tabla 2, página 475). El hapteno PCHAP se diferencia de los haptenos de la presente invención en que no existe un grupo cloro sobre el anillo de fenilo y no existe un grupo carbonilo sobre el anillo de ciclohexilo. La ausencia de estas dos unidades estructurales es, nuevamente, significativa, como lo demuestra la carencia de reactividad cruzada con cetamina.

Owens et al: (‘Molecular requirements for an immunological model of the fenciclidina receptor' Sigma y PCP-Like Compounds as Molecular Probes in Biology, 1988) describe la preparación de haptenos, inmunógenos y anticuerpos con PCP y otras arilciclohexilaminas (Tabla 1, página 667). Se preparan cuatro haptenos: PCHP; tPPC; PCHBA y PCHAP (ver la Fig. 1, página 665). Los anticuerpos generados exhibieron niveles altos de reactividad cruzada con PCP y con compuestos relacionados y niveles bajos de reactividad cruzada con cetamina, como se indica por medio de los altos valores de IC50 (Tabla 1, página 667). Una vez más, la ausencia de los grupos cloro y carbonilo es, de nuevo, significativa, como lo demuestra la carencia de reactividad cruzada con cetamina. Leung et al: (‘Comparative pharmacology in the rat of ketamine y its two principal metabolites, norketamine y (z)-6hydroxynorketamine'J. Med. Chem. (1986), 29(11), 2396-2399) describe la síntesis de (z)-6-hidroxinorcetamina (un metabolito secundario de cetamina) a partir de norcetamina, el metabolito primario de cetamina. Ellos también llevan a cabo estudios farmacológicos comparativos en ratas sobre la cetamina, norcetamina y (z)-6-hidroxinorcetamina. Leung et al no describen ni sugieren cómo elaborar haptenos, inmunógenos y anticuerpos con cetamina o norcetamina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe un hapteno derivatizado con un agente de entrecruzamiento en la posición N de la 40 norcetamina.

Preferiblemente, el hapteno tiene la siguiente fórmula estructural: en la cual R es un enlace bivalente y X es un grupo terminal.

**(Ver fórmula)**

Más preferiblemente, R incluye una unidad estructural de alquileno de cadena recta o ramificada, sustituida o no sustituida, saturada o insaturada; y X incluye un ácido carboxílico o un éster del mismo; una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un éster del mismo, un aldehído, una unidad estructural de ditiopiridilo, una unidad estructural de vinilsulfona o un ácido tiocarboxílico o un éster del mismo.

En consecuencia, en la fórmula de la modalidad preferida, el agente de entrecruzamiento contiene -R-X. El agente de entrecruzamiento, en el aspecto más amplio de la invención, puede contener también -R-X.

Más preferiblemente, R es una unidad estructural de alquileno C1-5, más preferiblemente C3, saturada, de cadena recta, sustituida o no sustituida.

Más preferiblemente, el sustituyente, si está presente, es un grupo carbonilo.

Convenientemente, X se selecciona... [Seguir leyendo]

1. Un inmunógeno para uso en la elevación de anticuerpos para detectar cetamina y norcetamina, comprendiendo el inmunógeno un hapteno de la norcetamina con derivación en el nitrógeno de la norcetamina; en el cual el hapteno de la norcetamina tiene la siguiente fórmula estructural:

**(Ver fórmula)**

en la cual R se selecciona del grupo que incluye una unidad estructural de alquileno de cadena recta o ramificada, sustituida o no sustituida, saturada o insaturada; y X se selecciona del grupo que incluye un ácido carboxílico o un éster del mismo; una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un éster del mismo, un aldehído, una unidad estructural de ditiopiridilo, una unidad estructural de vinilsulfona o un ácido tiocarboxílico o un éster del mismo y el hapteno está acoplado a un material portador que confiere antigenicidad.

2. Un conjugado que comprende un hapteno de la norcetamina con derivación en el nitrógeno de la norcetamina; en 15 el cual el hapteno de la norcetamina tiene la siguiente fórmula estructural:

**(Ver fórmula)**

en la cual R se selecciona del grupo que incluye una unidad estructural de alquileno de cadena recta o ramificada, sustituida o no sustituida, saturada o insaturada; y X se selecciona del grupo que incluye un ácido carboxílico o un éster del mismo; una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un éster del mismo, un aldehído, una unidad estructural de ditiopiridilo, una unidad estructural de vinilsulfona o un ácido tiocarboxílico o un éster del mismo y el hapteno está covalentemente enlazado con un agente de marcación detectable.

25 3. Un inmunógeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o un conjugado de acuerdo con la Reivindicación 2, en el cual R es una unidad estructural de alquileno C1-5, saturada, de cadena recta, sustituida o no sustituida.

4. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con la Reivindicación 3, en el cual R es una unidad estructural de alquileno C3, saturada, de cadena recta, sustituida o no sustituida.

5. Un inmunógeno de acuerdo con cualquiera de las 1. 3 ó 4 o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4, en el cual X se selecciona de una unidad estructural de ácido carboxílico, un ácido tiocarboxílico, un ditiopiridilo, una maleimida, o un aldehído.

35 6. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con la Reivindicación 5, en el cual X se selecciona de COOH o SCOCH3.

7. Un inmunógeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 ó 3 a 6 o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 6, en el cual el hapteno de la norcetamina se selecciona de los siguientes

40 derivados del hapteno de la norcetamina: N-(4'-carboxipropil) norcetamina; N-(3'-acetiltiopropil)norcetamina; y N-(3'acetiltiopropionamido)norcetamina.

8. Un inmunógeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 7, en el cual el material portador se selecciona de una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético o un polipéptido semisintético.

9. Anticuerpos producidos contra el inmunógeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 8, siendo capaces los anticuerpos de enlazamiento con al menos un epítopo estructural de norcetamina o cetamina.

10. Anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 9, en los cuales el epítopo estructural es una unidad estructural de arilciclohexanona.

11. Anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 10, en los cuales el epítopo estructural es una unidad estructural de clorofenilciclohexanona.

12. Anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 11, en los cuales el epítopo estructural es una unidad estructural de o-clorofenilciclohexanona.

13. El conjugado de cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7, en el cual el agente de marcación se selecciona de una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia radioactiva, o una mezcla de los mismos.

14. Un método in vitro para detectar cetamina y norcetamina en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el conjugado de cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7 y 13, o una mezcla de los mismos, y con los anticuerpos de cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12, o una mezcla de los mismos; la detección o determinación del conjugado enlazado; y la deducción a partir de una curva de calibración de la presencia de cetamina y norcetamina en la muestra.

15. Un kit para detectar cetamina y norcetamina, incluyendo el kit al conjugado de cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7 y 13, o una mezcla de los mismos; y los anticuerpos de cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12, o una mezcla de los mismos.

16. El uso in vitro de los conjugados de cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7 y 13, o una mezcla de los mismos, con los anticuerpos de cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12, o una mezcla de los mismos, para detectar cetamina y norcetamina en muestras tales como fluidos biológicos.