INHIBIDORES DE QUINASA DEPENDIENTES DE CICLINA DE PLANTA.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido ICK que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13 o 44

Solicitudes Relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional Estadounidense serie número 60/218,471, presentada en Julio 14, 2000 y de la solicitud de patente provisional Estadounidense serie número 60/241,219, presentada en Octubre 13, 2000.

Antecedente de la Invención

Cuando las células eucarióticas, por ejemplo, células de planta, se dividen ellas van a través de una secuencia altamente ordenada de eventos denominados colectivamente como el "ciclo celular." En resumen, la replicación o síntesis de ADN (S) y la segregación mitótica de los cromosomas (M) ocurre con fases de espacio que intervienen (G1 y G2) y las fases siguen la secuencia G1-S-G2-M. Se completa la división celular después de citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que se han salido del ciclo celular y que están en reposo se dice que están en la fase G0. Las células en la etapa G0 se pueden estimular para reingresar al ciclo celular en la fase G1.

La transición entre las diferentes fases del ciclo celular se conduce básicamente por la activación/inactivación secuencial de una quinasa, conocido como "quinasa dependiente de ciclina" o "CDK" mediante diferentes moléculas. Se requieren para la activación de la quinasas las proteínas denominadas ciclinas que también son importantes para objetivar la actividad quinasa a un sustrato dado (subconjunto de). Otros factores que regulan la actividad CDK incluyen inhibidores CDK (conocido como CKIs, ICKs, Kips, Cips, Inks, o KRPs, es decir, proteínas relacionadas con Kip), quinasa activante CDK (CAK), fosfatasa CDK (Cdc25), y subunidad CDK (CKS) (Mironov et al. (1999) Plant Cell 11, 509-522 y Reed (1996). Prog. Cell Cycle Res. 2, 15-27).

La existencia de un inhibidor de CDK mitótico se infiere de los experimentos con endosperma de semilla de maíz (Grafi and Larkins (1995) Science 269, 1262-1264) pero solo recientemente se identifican ICK en plantas. Se han descrito hasta la fecha un total de siete cADN de Arabidopsis, un Chenopodium rubrum, y uno de alfalfa ICK. Las proteínas codificadas se caracterizan por un alargamiento de aproximadamente 35 aminoácidos de terminal carboxi que muestra homología para el dominio de unión de ciclina/Cdk de Terminal amino de ICK de animal de los tipos p21Cip1/p27Kip1/p57Kip2. Fuera de la región de terminal carboxi, los ICK de planta no se relacionan uno con el otro y no se han detectado homologías con otras secuencias de proteína.

La Arabidopsis ICK 1 es capaz de inhibir la actividad quinasa de Cdc2 de planta, pero no la actividad quinasa del Cdc2 humano o de S. cerevisiae Cdc28. El Arabidopsis ICK3 también inhibe la actividad quinasa Cdc2 de planta. El ICK1 y el ICK3 interactúan con Arabidopsis Cdc2a (Cdk tipo A) y ciclina D3, pero no con Arabidopsis Cdc2b (Cdk tipo B). El ICK1 también interactúa con ciclina D1 y ciclina D2, pero no con ciclina A2, ciclina B1, ciclina B2, o PCNA. Como se determina por ensayos de dos híbridos de levadura, la interacción entre ICK1 y ciclina D3 es mucho más fuerte que entre ICK1 y Cdc2a. La región de terminal carboxi de ICK1 (homólogo a los ICK de animal Cip1/Kip1,2) se requiere para asociación con Cdc2a y ciclina D3. La unión de estos socios, sin embargo, se mejora fuertemente con un mutante de eliminación de terminal amino que comprende el alargamiento en la dirección 5' de aproximadamente 50 aminoácidos del dominio de unión de ciclina/Cdk ICK1 en conjunto con este dominio. El ICK1 tipo natural no se fija tan fuerte como Cdc2a o ciclina D3 como el mutante de eliminación anterior, que sugiere la presencia de elementos desestabilizantes en la región de terminal amino de ICK1.

La expresión de ICK1 es alta en las hojas y el ácido abscísico y la incubación en condiciones a baja temperatura, que inhiben la división celular de la planta, induce la acumulación de transcriptos ICK1 en semillas de Arabidopsis. La expresión del ICK2 es más prominente en los tallos en los ápices de florescencia, es más bajo en semillas de 1 mes de edad y el tratamiento sobreregulado con 0.1% de NaCl (WO 9914331, Lui et al. (2000) Plant J. 21, 379-385, Wang et al. (1997) Nature 386, 451-452, WO 9964599).

Se han generado plantas de Arabidopsis, Brassica napus y B. carinata transgénicas que expresan ICK1 bajo el control del promotor AP2 que sostiene la expresión preferida del polen o bajo el control del promotor Bgl1 específico a antera. Los niveles de mARN ICK1 incrementados en plantas Arabidopsis transgénicas (T1 y T2) se correlacionan con los efectos fenotípicos que varían de pétalos no visibles a pétalos visibles de tamaño reducido a pétalos normales. Solo las plantas con pétalos normales son auto fértiles. La semilla que se ajusta en las plantas transgénicas macho con los otros fenotipos se puede restaurar mediante fertilización con polen tipo natural. No se observa esterilidad macho significativa en plantas de Arabidopsis Bgl1-ICK1 transgénicas. Los efectos de AP2-ICK1 y Bgl1-ICK1 son menos severos y más pronunciados, respectivamente, en plantas Brassica transgénicas (W09964599).

**(Ver fórmula)**

Se han descrito muchas funciones diferentes para los ICADE de origen animal y estas incluyen: inhibición diferencial de la actividad de quinasa ciclina-Cdk, la regulación del ensamble del complejo ciclina-Cdk, la regulación concomitante de las células para dividir las señales mitogénicas y antimitogénicas integrantes, la regulación de la progresión del ciclo celular, regulación de replicación de ADN y reparación de ADN, regulación de trascripción de gen, regulación de degradación de ciclina, involucramiento en el retiro del ciclo celular y diferenciación celular, regulación de apoptosis, control de órgano y tamaño del organismo y regulación de endoreduplicación (Nakayama and Nakayama 1998 Bioessays 20, 1020-1029). Muchas de estas funciones se han atribuido a los dominios ICK fuera de las regiones de unión ciclina/Cdk.

En vista de la heterogeneidad de la secuencia inusualmente pronunciada entre los ICK de una única especie de planta y las diferencias en los patrones de expresión, se puede esperar que cada uno de los ICK de la planta sirva como única función para controlar el desarrollo de la planta. Tales funciones ICK de planta pueden incluir interferencia con eventos de ciclo celular similares a aquellos regulados por los ICK en animales pero aún no identificado en las plantas.

Resumen de la Invención

La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de moléculas novedosas, denominadas aquí como "Inhibidores de Quinasas Dependientes de Ciclina" o ácido nucleico "ICK" y moléculas de polipéptido. El ácido nucleico ICK y las moléculas de polipéptido de la presente invención son útiles como agentes de modulación en la regulación de la progresión del ciclo celular en, por ejemplo, plantas. El ácido nucleico ICK y las moléculas de polipéptido de la presente invención son particularmente útiles en agricultura y células de planta y cultivos de tejido.

En particular, la presente invención proporciona, con respecto a los estados designados CH, DE, FR, GB y LI, la materia objeto como se define en uno cualquiera o todos de (1A) a (16A) adelante:

(1A) Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido ICK que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 44.

(2A) Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 43:

(3A) Un polipéptido ICK aislado que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 44.

(4A) Una planta transgénica que comprende un casete de expresión recombinante que incluye un promotor de planta ligado operablemente a la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 43.

(5A) La planta transgénica como se establece en (4A) anterior, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

(6A) La planta transgénica como se establece en (4A) anterior, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

(7A) La planta transgénica como se establece en (4A) anterior, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, cebada, sorgo, tomate, papa, algodón, alfalfa, colza, soya, girasol, canola y maíz.

(8A) Un método para incrementar los números de semillas o vainas de semilla en una planta que comprende regulación descendente... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido ICK que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13 o 44.

2. Un polipéptido ICK aislado que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 43.

4. Un polipéptido ICK aislado que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 44.

5. Un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 13.

6. Una planta transgénica que comprende un casete de expresión recombinante que incluye un promotor de planta ligado operablemente a la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 43.

7. La planta transgénica de la Reivindicación 6, en donde la planta es una planta monocotiledónea.

8. La planta transgénica de la Reivindicación 6, en donde la planta es una planta dicotiledónea.

9. La planta transgénica de la Reivindicación 6, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, cebada, sorgo, tomate, papa, algodón, alfalfa, colza, soya, girasol, canola y maíz.

10. Un método para incrementar los números de semillas o vainas de semilla en una planta que comprende regulación descendente de la expresión de un inhibidor de proteína quinasa dependiente de ciclina (ICK) en la endosperma de la planta, en donde dicha proteína ICK es:

(a) OsICK4 que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13; o

(b) OsICK4 que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 44; o

(c) una proteína ICK funcionalmente activa que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia general para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13; o

(d) una proteína ICK funcionalmente activa que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia general para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 44; o

(e) una proteína ICK funcionalmente activa de acuerdo con cualquiera de (c) o (d) que comprende adicionalmente dos o más y preferiblemente todos los seis de:

(i) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido FIDKYNFD;

(ii) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido PLPGRWFEW;

(iii) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido ELEAFFAAEE;

(iv) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido YLELRSRR; y

(v) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido MGKYMRKAK; y

(vi) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido PLGVRTRA.

11. El método de la Reivindicación 10, en donde la dicha regulación descendente es por medio de una molécula de ácido nucleico anticodificante.

12. El método de la Reivindicación 11, en donde dicha molécula de ácido nucleico anticodificante es oligonucleótido anticodificante.

13. El método de la Reivindicación 10, en donde la dicha regulación descendente es por medio de una ribozima.

14. El método de la Reivindicación 10, en donde la dicha regulación descendente es por medio de cosupresión.

15. El método de cualquiera de reivindicaciones 10 a 14, en donde la dicha planta es una planta monocotiledónea.

16. El método de cualquiera de reivindicaciones 10 a 14, en donde la dicha planta es una planta dicotiledónea.

17. El método de cualquiera de reivindicaciones 10 a 14, en donde la dicha planta se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, arroz, trigo, cebada, sorgo, tomate, papa, algodón, alfalfa, colza, soya, girasol, canola y maíz.

18. El método de cualquiera de reivindicaciones 10 a 14, en donde la dicha planta es arroz.

19. Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de las reivindicaciones 2 o 4 que comprende: a) poner en contacto el polipéptido, o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto de prueba; y b) determinar sí el polipéptido se une al compuesto de prueba.

20. El método de la Reivindicación 19, en donde la unión del compuesto de prueba al polipéptido se detecta mediante un método que se selecciona del grupo que consiste de: a) detección de la unión mediante detección directa de la unión del compuesto de prueba/polipéptido; b) detección de la unión utilizando un ensayo de unión de competición; y c) detección de la unión utilizando un ensayo para la actividad de ICK.

21. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad un polipéptido de las reivindicaciones 2 o 4 que comprende: a) poner en contacto un polipéptido de la Reivindicación 2 o 4 con un compuesto de prueba; y b) determinar el efecto del compuesto de prueba en la actividad el polipéptido para identificar por lo tanto un compuesto que modula la actividad el polipéptido.

22. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido ICK monocotiledóneo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia general para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13, y que comprende uno o más y preferiblemente todos los tres de:

**(Ver fórmula)**

(i) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido FIDKYNFD;

(ii) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido PLPGRWFEW;

(iii) un motivo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido ELEAFFAAEE.