FOSFOTRIESTERASA A PARTIR DEL AGROBACTERIUM RADIOBACTER P230.

Un polipéptido purificado, el polipéptido que se selecciona de:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:2; o (ii) un polipéptido que comprende una secuencia que es más del 95% idéntica a (i), en donde el polipéptido es capaz de hidrolizar una molécula de organofosfato seleccionada del fosmet y el fentión

Campo de la invención:

Esta invención se relaciona con enzimas capaces de hidrolizar moléculas de organofosfato (OP). En particular, la invención se relaciona con una enzima fosfotriesterasa identificada a partir de una cepa Agrobacterium radiobacter aislada a partir del suelo que hidroliza los pesticidas OP, y el gen que codifica dicha enzima. También se describen en este documento los mutantes de la enzima fosfotriesterasa identificada, que han alterado la especificidad del sustrato.

Antecedentes de la invención:

Los residuos de los insecticidas organofosfatos son contaminantes indeseables del ambiente y un rango de productos. Las áreas de particular sensibilidad incluyen contaminación de los suelos, irrigación de aguas abajo que se reciclan, utilizadas por irrigadores de corriente abajo o simplemente dejándolas correr fuera de la granja, y los residuos por encima de los niveles permisibles de las exportaciones agrícolas y hortícolas. El envenenamiento con organofosfatos presenta un problema para los trabajadores agrícolas que se exponen a estos químicos, así como personal militar expuesto a organofosfatos utilizados en la guerra química. Adicionalmente, la acumulación de agentes nerviosos organofosforados se ha traducido en la necesidad de desintoxicar estas existencias. Por lo tanto se necesitan estrategias de bioremediación para eliminar o reducir estos residuos y/o existencias de organofosfatos.

Una estrategia propuesta involucra el uso de enzimas capaces de inmovilizar o degradar los residuos de organofosfatos. Tales enzimas se pueden emplear, por ejemplo, en bioreactores a través de los cuales agua contaminada se podría pasar, o en soluciones de lavado después de la desinfección pos-cosecha de frutas, vegetales o productos de animales para reducir los niveles de residuos y los tiempos de retención. Las enzimas apropiadas para degradar los residuos de organofosfatos incluyen hidrolasas de OP a partir de bacterias (Mulbry, 1992; Mulbry and Kearney, 19991; Cheng et al., 1999; US 5,484,728; US 5,589,386), vertebrados (Wang et al., 1993; 1998; Gan et al, 1991; Broomfield et al., 1999) e insectos resistentes a OP (WO 95/19440 y WO 97/19176). Es deseable que las hidrolasas de OP degraden los residuos de organofosfatos a una velocidad rápida.

La enzima degradante de OP más completamente estudiada es la dihidrolasa organofosfato (OPD) bacteriana, que se codifica por genes idénticos en diferentes plásmidos en tanto Flavobacterium sp. ATCC 27551 y Brevundimonas diminuta MG (Harper et al., 1988; Mulbry and Karns, 1989). La OPD es una proteína homodimérica que es capaz de hidrolizar un amplio rango de triésteres fosfato (tanto OPs oxon y tion) (Dumas et al., 1989a, b). Su mecanismo de reacción directa o indirectamente involucra iones metálicos, preferiblemente Zn++. La OPD no tiene actividad detectable con monoésteres o diésteres fosfato (Dumas et al., 1989a, b; 1990).

Los homólogos de OPD (proteínas que presentan homología con la fosfotriesterasa, o PHPs) han sido identificados en los genomas de Escherichia coli (ePHP), Mycobacterium tuberculosis (mtPHP) y Mycoplasma pneumoniae (mpPHP), aunque solo ePHP ha sido probada para la actividad fosfotriesterasa (Scanlan and Reid, 1995; Buchbinder et al., 1998). No se detectó actividad en lisados crudos de ePHP con ninguno de los sustratos probados, tales como p-nitrofenil acetato, bis(p-nitrofenil) fosfato, paraoxon y p-nitrofenil fosfato.

Los homólogos de OPD también han sido identificados en vertebrados (Davies et al., 1997), aunque su función en estos organismos se desconoce. OPD, ePHP, mtPHP y PHPs de mamíferos son 27-30% idénticos en el nivel aminoácido, mientras que mpPHP es menos similar. Los residuos de aminoácidos involucrados en el enlace Zn++ se conservan a través de los seis miembros de la familia fosfotriesterasa identificada hasta la fecha (Buchbinder et al., 1998).

Otras tres diferentes enzimas de hidrolización de OP, han sido aisladas a partir de bacterias con una historia de exposición a OPs (Mulbry and Karns, 1989; Mulbry, 1992; Cheng et al., 1999). Las dos para las cuales los datos de secuencia están disponibles no se relacionan entre sí y con OPD. Una, una prolidasa a partir de Alteromonas sp., normalmente funciona en la hidrólisis de dipéptidos X-Pro. Su actividad para insecticidas OPs se reporta como modesta, aunque no ha sido reportada en términos de especificidad kcat/Km constante (Cheng et al., 1999). La otra, una arildialquilfosfatasa (ADPasa) de la cepa de Nocardia sp. B-1, tiene un número de recambio para etil paratión que es 4500-veces inferior que aquel reportado para OPD (Mulbry and Karns, 1989; Mulbry, 1992).

La paraoxonasa, o PON1, es una enzima diferente que hidroliza el OP encontrado en mamíferos. Como OPD es una metaloenzima, que prefiere Ca++ en este caso, que se asocia con lipoproteínas de baja densidad en plasma y normalmente se involucra en el metabolismo de compuestos de lípidos oxidados (Gan et al., 1991; Sorenson et al., 1995). Esta tiene alta actividad para el paraoxon, con una especificidad constante de alrededor 106 M-1sec-1 (Doorn et al., 1999; Hong and Raushel, 1999).

Existe también evidencia de otras, enzimas así llamadas diisopropil fluorofosfatasa (DFPasa) en un amplio rango de vertebrados, invertebrados y microorganismos (Wang et al., 1998; Hoskin et al., 1999; Billecke et al., 1999). Estas enzimas son notablemente diversas en muchas de sus propiedades bioquímicas pero todas se caracterizan por su actividad hidrolítica contra agentes OP de guerra química. Los limitados datos de secuencia sugieren que no se relacionan con todas las otras enzimas hidrolíticas de OP descritas anteriormente.

Moscardones y moscas domésticas resistentes a OP, han sido la fuente de enzimas esterasas con actividad contra OPs oxon como el clorfenvinfos (CVP) y OPs carboxilester como malatión (Newcomb et al., 1997; Campbell et al. 1998; Claudianos et al. 1999; WO 95/19440; WO 97/19176). Un Gly para la sustitución de Asp en el residuo 137 en moscardón esterasa E3 (y su ortólogo de la mosca doméstica, ALI) da lugar a la adquisición de la actividad para CVP, mientras que un Trp para la mutación Leu/Ser en el residuo 251 en la misma enzima da lugar a actividad contra el malatión. Sin embargo, las constantes de especificidad de estas enzimas para sus sustratos OP tienen órdenes de magnitud menores que aquellas de OPD para el paraoxon.

Existe una necesidad de otra enzima que degrade los OPs, la cual se pueda utilizar en estrategias de bioremediación.

Resumen de la invención:

Los actuales inventores han desarrollado una prueba fluorométrica sensible y rápida para la hidrólisis del cumafos (un insecticida OP tion) y su uso para aislar una bacteria a partir de suelo contaminado que es capaz de utilizar OPs como la única fuente de fósforo. La secuenciación de ADNr 16S identificó la bacteria (aislado P230) como una cepa de Agrobacterium radiobacter. Los actuales inventores también han aislado y caracterizado la enzima responsable de esta actividad hidrolítica del cumafos y proporcionan los métodos para el uso de esta enzima en estrategias de bioremediación.

En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado, el polipéptido que se selecciona de:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:2; o

(ii) un polipéptido que comprende una secuencia que es más del 95% idéntica a (i),

en donde el polipéptido es capaz de hidrolizar una molécula de organofosfato seleccionada del fosmet y el fentión.

En una modalidad preferida, el polipéptido es al menos 97% idéntica a (i), e incluso más preferiblemente al menos 99% idéntica a (i).

En una modalidad, el polipéptido de la invención se selecciona de:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:1;

(ii) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:3; o

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:4.

En una modalidad preferida, el polipéptido de la invención además es capaz de hidrolizar las moléculas de organofosfatos incluyendo, pero no limitando a, cumafos, coroxon, paraoxon, paratión, metil paratión, diazinon, clorpirifos, dMUP, DFP, dimetoato, malatión, y malaoxon.

En una modalidad preferida, el polipéptido se puede purificar a partir de un Agrobacterium sp.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido de fusión, que... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido purificado, el polipéptido que se selecciona de:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:2; o

(ii) un polipéptido que comprende una secuencia que es más del 95% idéntica a (i), en donde el polipéptido es capaz de hidrolizar una molécula de organofosfato seleccionada del fosmet y el fentión.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido se selecciona de:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:1;

(ii) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:3; o

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:4.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la molécula de organofosfato además se selecciona del grupo que consiste de: cumafos, coroxon, paraoxon, paratión, metil paratión, diazinon, clorpirifos, dMUP, DFP, dimetoato, malatión, y malaoxon.

4. Un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o la reivindicación 3, fusionado a al menos otra secuencia de polipéptidos.

5. El polipéptido de fusión de la reivindicación 4, en donde al menos otro polipéptido es una proteína de enlace de maltosa.

6. Un polinucleótido aislado, el polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de:

(i) una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:5;

(ii) una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:6;

(iii) una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:7;

(iv) una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8;

(v) una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; o

(vi) una secuencia que es al menos 90% idéntica a cualquiera de (i) a (v),

en donde el polinucleótido codifica un polipéptido capaz de hidrolizar una molécula de organofosfato seleccionada del fosmet y el fentión.

7. Un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.

8. El vector de la reivindicación 7, el cual es un vector viral.

9. El vector de la reivindicación 7, el cual es un vector plásmido.

10. Una célula huésped no-humana que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a

9.

11. Un proceso de preparación de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el proceso que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, bajo condiciones que permiten la producción del polipéptido, y la recuperación del polipéptido.

12. Una composición para hidrolizar una molécula de organofosfato, la composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y uno o más portadores aceptables.

13. Una composición para hidrolizar una molécula de organofosfato, la composición que comprende una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, y uno o más portadores aceptables.

14. Un método para hidrolizar una molécula de organofosfato en una muestra, el método que comprende la exposición de la muestra a un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el polipéptido se proporciona como una composición de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

16. El método de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, que además comprende la exposición de la muestra a un catión divalente.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el catión divalente es el zinc.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de suelo, agua, material biológico, o una combinación de estos.

19. Una planta transgénica que produce un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

20. Un método para hidrolizar una molécula de organofosfato en una muestra, el método que comprende la exposición de la muestra a una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 19.

21. Una cepa aislada de Agrobacterium radiobacter depositada bajo NM01/21112 el 20 de Abril 2001 en Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano.

22. Una composición para hidrolizar una molécula de organofosfato, la composición que comprende la cepa Agrobacterium radiobacter de la reivindicación 21, y uno o más portadores aceptables.

23. Un método para hidrolizar una molécula de organofosfato en una muestra, el método que comprende la exposición de la muestra a una cepa Agrobacterium radiobacter de acuerdo con la reivindicación 21.

24. Una espuma o esponja polimérica para hidrolizar una molécula de organofosfato, la espuma o esponja que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, inmovilizado sobre un soporte poroso polimérico.

25. La espuma o esponja polimérica de la reivindicación 24, en donde el soporte poroso comprende poliuretano.

26. La espuma o esponja polimérica de la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en donde la esponja o espuma además comprende carbón incrustado o integrado sobre o en el soporte poroso.

27. Un método para hidrolizar una molécula de organofosfato en una muestra, el método que comprende la exposición de la muestra a una esponja o espuma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26.

28. Un biosensor para detectar la presencia de un organofosfato, el biosensor que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un medio para detectar la hidrólisis de una molécula de organofosfato mediante el polipéptido.