ELECTROPORACIÓN DE MYCOBACTERIUM Y SOBREEXPRESIÓN DE ANTÍGENOS EN MICOBACTERIAS.

Electroporación de mycobacterium y sobreexpresión de antígenos en micobacterias. Antecedentes de la invención Campo de la invención La invención proporciona cepas de Mycobacterium con propiedades de vacuna mejoradas para su uso como agentes de vacunación contra la tuberculosis. Las cepas de Mycobacterium se seleccionan preferiblemente de cepas progenitoras que se identifica que tienen potente inmunogenicidad, no manifiestan resistencia a antibióticos y no presentan transferencia horizontal a bacterias gram-negativas. La invención también proporciona Mycobacterium con propiedades mejoradas para suministrar transgenes que tendrán propiedades de vacuna para su uso en la vacunación contra otras enfermedades y para su uso en el tratamiento de cáncer. Antecedentes Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ha infectado a un tercio de la población mundial, provocando enfermedad activa en 8 millones y matando a 1,6-2,2 millones de individuos cada año, la mayoría de los cuales viven en el mundo en vías de desarrollo. La tuberculosis (TB) es una epidemia de proporciones globales que está creciendo y se está haciendo incluso más mortífera al cruzarse con la propagación del VIH. La TB es la enfermedad que provoca más muertes de personas con SIDA. BCG, la vacuna contra TB ampliamente usada actualmente, se desarrollo hace más de 80 años y cuando se sometió a prueba ha tenido tasas de eficacia ampliamente variables contra la tuberculosis pulmonar, incluyendo ninguna eficacia en el último ensayo de campo extenso llevado a cabo en India (Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anonymous, Indian J Med Res., agosto; 110:56-69; 1999. No obstante, la Organización Mundial de la Salud actualmente recomienda BCG en el nacimiento o primer contacto con los servicios de salud para todos los niños (excepto aquellos con síntomas de enfermedad de VIH/SIDA) en países con alta prevalencia de TB. Esta política se basa en la evidencia de que BCG protege contra formas infantiles graves de TB (Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5): 1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45(1): 78-80; 1991. La protección mediante BCG contra la TB más allá de la infancia temprana es un tema controvertido con datos limitados que proporcionan resultados mixtos. La alta incidencia de TB pediátrica y adulta en países en vías de desarrollo en los que se practica ampliamente inmunización con BCG infantil, sin embargo, indica que BCG tal como se administra actualmente no es altamente eficaz a lo largo de los muchos años en los que las personas corren el riesgo de la enfermedad de TB. Por tanto, se considera que BCG es una herramienta de salud pública inadecuada para la intervención y el control de la TB. Aproximadamente el 70 por ciento de los seres humanos expuestos a organismos de TB, y que tienen sistemas inmunitarios normales, no se infectan, y de los que sí se infectan sólo aproximadamente el 5 por ciento desarrollan la enfermedad en el plazo de los primeros dos años. La mayoría de individuos infectados suprimen la infección, que está asociada con el desarrollo de respuestas inmunitarias celulares robustas frente a antígenos de M. tb. Un 5 por ciento adicional se reactivan más tarde cuando disminuye la inmunidad. Tanto la enfermedad primaria como la reactivación son mucho más comunes en personas con VIH/SIDA, lo que enfatiza nuevamente el papel de la inmunidad en la prevención y control de la infección. Sumario de la invención Debido a que la mayoría de los seres humanos pueden controlar la TB, existe una buena razón para esperar que induciendo inmunidad larga duración de la clase apropiada sería posible desarrollar vacunas eficaces que prevengan la infección inicial tras la exposición, prevengan la evolución temprana hasta la enfermedad, prevengan la reactivación del estado latente y prevenga la recidiva tras el tratamiento. En última instancia, es la combinación de uso de vacuna sistemático más la intervención quimioterápica la que finalmente eliminará M. tb como patógeno humano. En vista del papel crítico que se piensa que la vacunación con BCG infantil desempeña en la prevención de la TB aguda, es difícil reemplazar BCG en ensayos para evaluar vacunas contra la TB candidatas sin pruebas abrumadoras de que la nueva vacuna contra la TB es un producto superior. El problema es que M. tb es principalmente un patógeno específico de ser humano y los modelos animales sólo imitan partes de la interacción huésped-patógeno. Por tanto, sólo pueden obtenerse pruebas definitivas de que una nueva vacuna contra la TB posee potencia mejorada a partir de ensayos de campo controlados en seres humanos. Estas consideraciones conducen a muchos investigadores a concluir que una etapa clave hacia una vacuna contra la TB mejorada será desarrollar cepas mejoradas de BCG, y los modelos animales, a pesar de sus limitaciones, sugieren que BCG recombinantes que sobreexpresan antígenos protectores tienen potencia aumentada en comparación con BCG. 2   Ciertos antígenos de M. tb poseen propiedades de vacuna y, cuando se administran a animales como formulaciones de vacuna, confieren una protección que es similar a la lograda mediante BCG solo (Anderson, Infect Immun 62(6) 2536-2544; 1994). Para hacer avanzar estos candidatos, se desarrolló una estrategia para potenciar la inmunogenicidad de tales antígenos en BCG. Por tanto, se desarrollaron cepas BCG que sobreexpresan antígenos de M. tb seleccionados y se mostró que estas cepas de BCG recombinantes (rBCG) inducían una protección más fuerte en comparación con las cepas de BCG progenitoras a partir de las que se derivó la cepa rBCG (Horwitz et al., Infect Immun 72(4): 1672-1679; 2003). En un estudio, una cepa rBCG que expresaba el antígeno 85B (denominado en el presente documento Ag85B) demostró ser más eficaz que BCG mezclado con el mismo antígeno (Horwitz et al., citado anteriormente, 2003). Basándose en estos hallazgos, este enfoque tiene un potencial tremendo. Baulard, A. et al., Gene, 1996, 176, 1-2, páginas 149-154 enseñan un vector de expresión de Mycobacterium que contiene genes resistentes a mercurio. El vector allí descrito se perderá finalmente en la progenie del Mycobacterium transformado. El documento US-A-5.736.367 enseña un vector que cuando se transforma en una bacteria huésped provoca que un gen de interés se integre en el cromosoma del huésped. Además, el vector emplea genes de resistencia a antibióticos. Una progenie de la misma contendrá el gen de interés integrado. McShane, H. et al., Nature Medicine, 2004, 10, 11, páginas 1240-1244 enseñan la conveniencia de usar el antígeno 85A para su uso en vacunas útiles para inmunidad anti-micobacteriana adquirida de manera natural y sensibilizada con BCG en seres humanos. El documento US-B2 6.562.348 da a conocer un auxótrofo para leucina de M. tb para su uso como vacuna. Sin embargo, el M. tb descrito en el mismo no sería viable cuando se administra a un huésped, no codifica para ninguno de los otros antígenos o genes de interés y no alberga a un plásmido. En ciertas circunstancias pueden usarse cepas de BCG que sobreexpresan antígenos para provocar de manera segura y eficaz respuestas inmunitarias que confieren protección frente a la infección por TB. La presente invención proporciona cepas de Mycobacterium modificadas por ingeniería genética (recombinantes) con propiedades de vacuna mejoradas para su uso como agentes de vacunación contra la tuberculosis. Poseen una variedad de características, cada una de las cuales sirve para aumentar la inmunogenicidad de las cepas. Las cepas de Mycobacterium recombinantes de la presente invención se desarrollan a partir de cepas progenitoras que se seleccionan a propósito por su potente inmunogenicidad. En otras palabras, la cepa de Mycobacterium que se selecciona como cepa progenitora para someterse a manipulación genética (por ejemplo, para sobreexpresar un antígeno de tuberculosis) se escoge porque, incluso antes de la manipulación genética, presenta la capacidad para provocar una potente respuesta inmunitaria en un huésped vacunado. La cepa de BCG Danish 1331 es un ejemplo. Tales cepas se modifican entonces preferiblemente, por ejemplo, para sobreexpresar un antígeno de tuberculosis de interés. Preferiblemente, se usa un promotor que se activa in vivo en el Mycobacterium genéticamente recombinantes. Además, las cepas de Mycobacterium recombinantes de la presente invención se modifican por ingeniería genética para que puedan seleccionarse en una base distinta de la resistencia a antibióticos o se construyen de tal manera que no necesitan marcadores selectivos en absoluto, lo que las hace generalmente seguras para su uso como agentes de vacunación en poblaciones humanas. Como ejemplo, se elimina un gen requerido para la replicación micobacteriana y se coloca en un plásmido de expresión.... [Seguir leyendo]

1. Micobacteria transformada o progenie de la misma que incorpora una secuencia de nucleótidos foránea, que se replica y se expresa en la misma, en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea no está unida a un marcador seleccionable y en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea se encuentra en un plásmido, dicho plásmido codifica para un gen requerido para la supervivencia, y dicho gen requerido para la supervivencia se deleciona del genoma bacteriano de dicha bacteria transformada. 2. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea codifica para el antígeno 85a, el antígeno 85b o el antígeno 85a/85b. 3. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicho plásmido alberga un gen que codifica para proteínas que mantienen y/o estabilizan el plásmido. 4. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 3, en la que dicho gen que codifica para proteínas codifica para el antígeno 85a, el antígeno 85b o el antígeno 85a/85b. 5. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dichas secuencias de nucleótidos foráneas codifican para mediadores para la apoptosis expresando también antígenos tumorales específicos. 6. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicho plásmido alberga un gen que codifica para secuencias de nucleótidos foráneas que codifican para mediadores para la apoptosis expresando también antígenos tumorales específicos para la apoptosis. 7. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea no puede replicarse en bacterias Gram negativas. 8. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria transformada es auxótrofa. 9. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea es al menos una parte de un vector lanzadera unidireccional. 10. Método de producción de una micobacteria transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa de incorporar una secuencia de nucleótidos foránea que se replica y se expresa en dicha bacteria, en el que dicha secuencia de nucleótidos foránea no está unida a un marcador seleccionable. 11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha etapa de incorporación se realiza mediante electroporación. 12. Método según la reivindicación 10, en el que dicha secuencia de nucleótidos foránea está en un plásmido y dicha electroporación se realiza en las siguientes condiciones: una razón de ADN de plásmido con respecto a células bacterianas que oscila entre 1 µg y 5 µg de ADN de plásmido con respecto a 1,25 x 10 8 células bacterianas. 13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha razón es de aproximadamente 1,6 µg de plásmido con respecto a aproximadamente 1,25 x 10 8 células bacterianas. 14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de nucleótidos foránea no puede replicarse en bacterias Gram negativas. 15. Método según la reivindicación 10, en el que dicha secuencia de nucleótidos foránea es al menos una parte de un vector lanzadera unidireccional. 16. Micobacteria transformada o progenie de la misma que comprende una secuencia de nucleótidos foránea que codifica para un gen de interés, en la que existen una o más de las siguientes condiciones: a) dicha micobacteria transformada incluye un plásmido que no puede replicarse en bacterias Gram negativas o b) dicha micobacteria transformada no muestra resistencia a antibióticos o c) dicha micobacteria transformada es auxótrofa o   d) dicha micobacteria transformada alberga un vector lanzadera unidireccional, y en la que dicha secuencia de nucleótidos foránea es parte de un plásmido y dicha secuencia de nucleótidos foránea codifica para un gen requerido para la supervivencia, y en la que dicho gen requerido para la supervivencia se deleciona del genoma bacteriano de dicha micobacteria transformada. 17. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 16, en la que dicho plásmido carece de un marcador seleccionable. 18. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 16, en la que dicho gen requerido para la supervivencia es leuD. 19. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 16, que comprende además secuencias promotoras que se activan in vivo. 20. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 16, estando dicha micobacteria transformada atenuada. 21. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 20, siendo dicha micobacteria transformada BCG. 22. Micobacteria transformada o progenie de la misma según la reivindicación 21, en la que dicho BCG se selecciona de las siguientes cepas BCG1331, BCG Pasteur, BCG Tokio y BCG Copenhague. 23. Vacuna que comprende una micobacteria transformada o progenie según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22. 21   22   23   24     26