PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA FUNCIÓN PLAQUETARIA Y LAS CONDICIONES DE FLUJO.

Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre completa,

en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos: a) conducción de la sangre a través de un capilar y, posteriormente, a través de una abertura de un elemento de separación que contiene, al menos, un activador de trombocitos del grupo de activadores de receptores de adenosina; y b) medición del tiempo necesario para la formación de un trombo en la abertura del elemento de separación hasta el cierre de dicha abertura; caracterizado porque antes del paso a través del capilar, la muestra de sangre completa es mezclada con prostaglandina E1 en una concentración final de 11 a 13 nM o con forskolina en una concentración final de 0,1 a 5 μM

La presente invención se enmarca en el sector de diagnóstico de función de plaquetaria y comprende un procedimiento in vitro para determinar la función plaquetaria en condiciones de flujo. El 5 procedimiento es especialmente adecuado para determinar el efecto de clopidogrel tras la ingesta oral, y de otros antagonistas P2Y(12) de acción antitrombótica, así como para determinar antagonistas de acción antitrombótica del receptor P2Y(1).

Los procesos fisiológicos que, por un lado, garantizan la fluidez de la sangre en el sistema vascular y, por otro lado, aseguran, gracias a la formación de trombosis, que se impida la pérdida de 10 sangre extravascular, se reúnen bajo el término hemostasis. En la regulación de la hemostasis intervienen una gran cantidad de factores proteicos, así como también componentes celulares, por ejemplo, trombocitos (plaquetas). En el caso de una lesión vascular, primero se forma una acumulación de trombocitos en el colágeno subendotelial. Dicha adhesión se transmite a través de proteínas adhesivas, como aquellas del factor von Willebrand (VWF). Durante el proceso de adhesión, 15 los trombocitos son activados y vierten mediadores de sus gránulos, por lo cual se induce la agregación de otros trombocitos así como el fortalecimiento de la activación. De este modo, se lleva a cabo un cierre vascular primario (hemostasis primaria), que sólo se estabiliza a través de otras reacciones del sistema coagulante plasmático (hemostasis secundaria). Las regulaciones fallidas de dichos procesos pueden provocar una tendencia a la trombosis o a una tendencia a hemorragia y 20 tener consecuencias fatales, según el grado de complejidad.

En el diagnóstico de coagulación se desarrollaron diferentes procedimientos de prueba in vitro, con los que se puede determinar si la sangre de un paciente puede coagular perfectamente o si existe una disfunción en la coagulación. En el caso de una disfunción en la coagulación, a menudo es necesario saber con precisión la causa de la disfunción existente, para poder seleccionar medidas 25 terapéuticas óptimas. Una función parcial importante del sistema de coagulación, que puede ser analizado adecuadamente, es la hemostasis primaria, que depende, fundamentalmente, de la capacidad de funcionamiento de los trombocitos.

Los procedimientos para determinar la función plaquetaria no sólo se utilizan para el diagnóstico de disfunciones heredadas o adquiridas en la función plaquetaria, sino también para el 30 control de terapias antitrombóticas. Los medicamentos que inhiben la agregación de trombocitos se utilizan, predominantemente, en la profilaxis y la terapia de eventos tromboembólicos arteriales, como infarto de miocardio o apoplejía. Las sustancias activas más difundidas con efecto inhibidor de agregación de trombocitos son el ácido acetilsalicílico (ASS) y las tienopiridinas clopidogrel y ticlopidina. El ASS inhibe de modo irreversible la ciclooxigenasa-1 (CQX-1), una enzima intracelular 35 que participa de la síntesis de tromboxano A2, que estimula la agregación de trombocitos. El clopidogrel y la ticlopidina pertenecen a la clase de los antagonistas P2Y(12), debido a su mecanismo de acción. Tras la ingesta oral de clopidogrel o ticlopidina se producen metabolitos en el hígado que bloquean selectivamente el receptor P2Y(12). El receptor P2Y(12) purinérgico se expresa en la superficie de los trombocitos y se puede activar a través de 5'-difosfato extracelular de adenosina 40 (ADP). Como consecuencia de la activación del receptor P2Y(12), se desencadenan procesos intracelulares en los trombocitos, por ejemplo, la inhibición de la formación de cAMP, que originan una reacción de agregación de trombocitos. Los antagonistas P2Y (12) bloquean los receptores P2Y(12) en la superficie de los trombocitos y por ello presentan una acción antitrombótica.

El segundo receptor ADP P2Y(1) purinérgico también se expresa en la superficie de los 45 trombocitos y se puede activar a través de 5'-difosfato extracelular de adenosina. Como consecuencia de la activación del receptor P2Y(1), se desencadenan procesos intracelulares en los trombocitos, por ejemplo, el incremento del calcio intracelular, que originan una reacción de agregación de trombocitos. Los antagonistas del receptor P2Y(1) contrarrestan dicho proceso y por ello presentan una acción antitrombótica. 50

Un conocimiento preciso del estado de la función plaquetaria de pacientes que reciben terapia antitrombótica se considera cada vez más importante, ya que, por ejemplo, la presencia de una denominada resistencia al clopidogrel debe ser considerado un serio factor de riesgo. Se habla de una resistencia al clopidogrel cuando la función plaquetaria de un paciente no es influida o es escasamente influida por la suministración de la dosis estándar de clopidogrel. Determinando la 55

función plaquetaria se puede verificar, por un lado, si a través de la dosificación seleccionada realmente se logra un efecto antitrombótico suficiente. Por otro lado, se pueden comprobar y tratar dosificaciones demasiado elevadas o efectos de un medicamento antitrombótico, lo cual es necesario, por ejemplo, antes de intervenciones operativas para excluir complicaciones hemorrágicas.

Por el estado actual de la técnica se conocen diferentes procedimientos para el análisis de 5 la función plaquetaria. En el caso de la determinación de hemorragias se trata de una prueba global en vivo, que registra la hemostasis primaria. El tiempo de hemorragia se determina realizando en el paciente pequeñas lesiones de corte o pinchazo y midiendo el tiempo necesario para detener la hemorragia. Se trata de una prueba de difícil estandarización, que brinde información aproximada, aplicada, sobre todo, en situaciones de urgencia, para obtener una vista general de la hemostasis 10 primaria. La ingesta de inhibidores de la agregación de trombocitos produce una prolongación del tiempo de hemorragia. La desventaja de la determinación del tiempo de hemorragia es que en un tiempo de hemorragia normal no se puede excluir la disfunción de la función plaquetaria.

Diferentes procedimientos in vitro posibilitan una determinación notablemente más sensible de disfunciones de la función plaquetaria. En dichos procedimientos, en una muestra de sangre 15 completa, o en una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP), usualmente se induce la agregación de trombocitos a través de la adición de un activador y se mide la reacción de agregación. Los activadores más utilizados, que se implementan en la inducción de la agregación de trombocitos, son: ADP (5'-difosfato de adenosina), colágeno, epinefrina (adrenalina), ristocetina y diferentes combinaciones de ellos, así como trombina, TRAP (Thrombin-Receptor-Activating-Protein, o proteína 20 activadora de receptor de trombina) o serotonina.

En la geometría de agregación de transmisión luminosa, también denominada agregación de plaquetas, según Born, se mide fotométricamente la capacidad de agregación de los trombocitos en el plasma rico en plaquetas, en presencia de sustancias que inducen la agregación, en un agregómetro. A través de la formación de agregados, se incrementa la transparencia al paso de la luz 25 de la muestra PRP, de modo que a través de la medición de la transparencia al paso de la luz se puede determinar, por ejemplo, la velocidad de la formación de agregados. Mediante la geometría de agregación de transmisión luminosa también pueden determinarse efectos terapéuticos de inhibidores de agregación de trombocitos de uso medicamentoso. Una desventaja de la geometría de agregación de transmisión luminosa es que se puede utilizar exclusivamente plasma rico en plaquetas como 30 material de muestra. En el plasma rico en plaquetas no sólo faltan importantes componentes de la sangre, por ejemplo, glóbulos rojos y blancos, sino que, además, requiere de una preparación prolongada y falible de la muestra.

Otro principio de prueba para determinar la función plaquetaria fue llevado a la práctica en el Platelet Function Analyzer, o analizador de la función plaquetaria (PFA- 100®, Dade Behring 35 Marburg GmbH, Marburgo, Alemania). El PFA-100® es una prueba in vitro de sangre completa global, automatizada y estandarizada en la cual se mide la hemostasis primaria en condiciones de flujo y, con ello, en presencia de fuerza elevadas de cizallado. Para la simulación de las condiciones de flujo y de las fuerzas de cizallado, como las que reinan en vasos sanguíneos arteriales reducidos, en una célula de medición especial se genera una baja presión de, aproximadamente, -40 mbar, y la sangre 40 completa de citrato que se...

1. Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre completa, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos:

a) conducción de la sangre a través de un capilar y, posteriormente, a través de una abertura de un elemento de separación que contiene, al menos, un activador de 5 trombocitos del grupo de activadores de receptores de adenosina; y

b) medición del tiempo necesario para la formación de un trombo en la abertura del elemento de separación hasta el cierre de dicha abertura;

caracterizado porque antes del paso a través del capilar, la muestra de sangre completa es mezclada con prostaglandina E1 en una concentración final de 11 a 13 nM o con 10 forskolina en una concentración final de 0,1 a 5 μM.

2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento de separación utilizado en el paso a) contiene, al menos, un activadores de receptores de adenosina del conjunto de 5'-difosfato de adenosina, 5'-difosfato de 2-metiltioadenosina y sus derivados.

3. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el 15 elemento de separación utilizado en el paso a) contiene, adicionalmente, colágeno.

4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque a la muestra de sangre completa se le agrega forskolina en una concentración final de 0,5 a 2,5 μM, de modo especialmente preferido, de 1,0 a 1,5 μM.

5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la 20 muestra de sangre completa es anticoagulada con citrato, un inhibidor directo de la trombina, o un inhibidor de factor Xa directo.

6. Utilización de un procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 5 para determinar el efecto antitrombótico de un antagonista P2Y(12).

7. Utilización acorde a la reivindicación 6 para determinar el efecto antitrombótico de un 25 antagonista P2Y(12) del conjunto de clopidogrel, ticlopidina, prasugrel, MRS 2395, AR-C67085MX, cangrelor, C1330-7 y 5'-monofosfato 2-metiltioadenosina .

8. Utilización de un procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 5 para determinar el efecto antitrombótico de un antagonista P2Y(1).

9. Utilización acorde a la reivindicación 8 para determinar el efecto antitrombótico de un 30 antagonista P2Y(1) del conjunto de MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, 2',5'-bisfosfato de adenosina, 3',5'-bisfosfato de adenosina y 3'-fosfato,5'-fosfosulfato de adenosina.

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