PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE ORGANISMOS BIOLÓGICOS USANDO DISPERSIÓN RAMAN.

Un procedimiento para detectar un organismo o componente biológico en una muestra,

que comprende: a) proporcionar una pareja de unión específica para el organismo o componente biológico, en el que la pareja de unión específica está unida a una superficie sólida; b) proporcionar uno o más reaccionantes que se unirán a la combinación del organismo o componente biológico y la pareja de unión específica, en el que el uno o más reaccionantes comprenden una o más enzimas que convierten uno o más reaccionantes en uno o más productos activos en Raman; y c) decantar y lavar para separar el organismo, componente biológico o reaccionante no unidos; y d) detectar el uno o más productos activos en Raman con un subsistema de detección que usa la dispersión de luz Raman, y en el que la dispersión de luz Raman no es dispersión por interacción con una superficie sólida.

La presente descripción se refiere en general al campo del equipamiento para el diagnóstico y a procedimientos de ensayo biológicos.

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/836.936 presentada el 11 de agosto, 2006, y solicitud provisional de EE.UU. nº 60/727.328 presentada el 17 de octubre de 2005.

Actualmente hay muchos campos que necesitan sistemas para detectar organismos o componentes biológicos (p. ej., proteínas, ADN u otro material genético). Estos campos incluyen: seguridad alimentaria, diagnósticos médicos, diagnósticos veterinarios, detección de patógenos y seguridad nacional. Los procedimientos actuales incluyen inmunoquímica, biología molecular o técnicas biológicas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y reacciones en cadena de la ligasa (LCR). Estos procedimientos y técnicas a menudo están limitados en precisión, especificidad y sensibilidad.

Por ejemplo, los diagnósticos médicos usan técnicas inmunoquímicas para proporcionar especificidad en la detección de componentes biológicamente activos de una muestra. Se sabe que los anticuerpos desarrollados para compuestos específicos tienen una alta afinidad por estos componentes. Los propios anticuerpos proporcionan detectabilidad limitada y como tales se modifican químicamente con marcadores o etiquetas que sirven para potenciar la detección del anticuerpo durante una reacción con el componente biológico objetivo. De esta forma, las técnicas anteriores pueden identificar un componente biológico. Desgraciadamente, la capacidad para detectar el anticuerpo tiene tendencia a la interferencia de otras cosas en la muestra, incluyendo la matriz de la muestra, los componentes de lavado y otros agentes químicos. Además, las técnicas de detección actuales carecen de sensibilidad a concentraciones o número de anticuerpos bajos (es decir, concentraciones o número bajos de los componentes biológicos objetivo).

Las técnicas de dispersión de luz Raman (Espectroscopía Raman) se han usado en el pasado para detectar componentes químicos específicos. La dispersión Raman es una propiedad básica de la interacción de la luz con las moléculas. Cuando la luz impacta con una molécula puede hacer que los átomos de la molécula vibren. Esta vibración cambiará entonces la energía de la luz adicional que impacta con la molécula. Esta luz dispersada adicional tiene características que se pueden medir y son únicas de la estructura de la molécula que ha hecho que vibre. La espectroscopía Raman por sí misma carece de la especificidad y sensibilidad para detectar organismos y componentes biológicos.

Se hace referencia a determinados documentos de la técnica anterior. SENGUPTA A y col.: "Bioaerosol characterization by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)" J. AEROSOL SCI.; JOURNAL OF AEROSOL SCIENCE; MEASUREMENT AND CHARACTERIZATION OF BIOAEROSOLS, MAYO/JUNIO 2005, vol. 36, no. 5-6, Mayo 2005 (2005-05), páginas 651-664, describen que las bacterias se pueden detectar usando SERS. Las bacterias se pueden detectar usando SERS sin el uso de un reactivo activo en Raman específico para la bacteria, combinando una bacteria aerosolizada con suspensiones nanocoloidales de plata.

El documento US 2003/059820 y MOSIER-BOSS P.A. y col.: "Surface-enhanced Raman spectroscopy substrate composed of chemically modified gold colloid particles immobilized on magnetic microparticles." ANALYTICAL CHEMISTRY 15 FEB 2005, vol. 77, no. 4, 15 de febrero 2005 (2005-02-15), páginas 1031-1037, describen determinados compuestos que se pueden usar como marcadores en SERS/Raman.

El documento WO 204/007767 describe que las moléculas objetivo se pueden detectar usando perlas de polímero activo en SERRS.

XU SHUPING y col.: "Surface-enhanced Raman scattering studies on immunoassay" J. BIOMED. OPT.; JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS MAYO/JUNIO 2005, vol. 10, no. 3, Mayo 2005 (2005-05), páginas 1-12 y DRISKELL JEREMY D y col.: "Low-level detection of viral pathogens by a surface-enhanced Raman scattering based immunoassay." ANALYTICAL CHEMISTRY 1 OCT 2005, vol. 77, no. 19, 1 de octubre 2005 (2005-10-01), páginas 6147-6154, proponen que las limitaciones de la espectroscopía Raman en la detección de moléculas biológicas se pueden superar mediante el uso de SERS.

GROW ANN E y col.: "New biochip technology for label-free detection of pathogens and their toxins." JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS MAYO 2003, vol. 53, no. 2, Mayo 2003 (2003-05), páginas 221-233, sugieren que determinadas bacterias se pueden detectar sin usar un reactivo activo en Raman específico para la bacteria, detectando el espectro Raman característico producido por la bacteria.

La presente descripción se dirige a un sistema que usa la combinación de espectroscopía Raman y técnicas de marcaje biológico para identificar y cuantificar organismos y componentes biológicos con una sensibilidad y especificidad mayores que en las técnicas anteriores. Específicamente, el uso de la presente descripción para detectar las combinaciones de anticuerpo/componente biológico se puede realizar usando un inmunoensayo seguido de técnicas de detección por dispersión Raman. La presente invención se refiere a los procedimientos como se definen en las reivindicaciones.

En una realización, la presente invención usa la combinación de espectroscopía Raman y técnicas de marcaje biológico para identificar y cuantificar componentes biológicos, tales como proteínas o péptidos, incluyendo cualquier modificación postraduccional, en conformaciones o condiciones específicas asociadas con la enfermedad: por ejemplo, proteínas priones.

El inmunoensayo para determinadas realizaciones de la presente invención implica primero tener un anticuerpo unido a una superficie sólida que se une al componente biológico objetivo. Los componentes no unidos de la muestra de ensayo después se arrastran por lavado dejando solo las combinaciones unidas de componente biológico/anticuerpo. En este punto la combinación de componente biológico/anticuerpo combinada se puede detectar por dispersión Raman de luz ultravioleta.

Para aumentar la sensibilidad se contempla una etapa adicional, en la que después se introducen uno

o más reaccionantes nuevos y quedan unidos a la combinación de componente biológico/anticuerpo. La combinación del o de los nuevos reaccionantes con la combinación de componente biológico/anticuerpo ahora se puede detectar usando dispersión de luz Raman. Los ejemplos de dichos reaccionantes incluyen, pero sin limitar:

1. anticuerpos marcados con moléculas activas en Raman;

2. conjugados de enzima/anticuerpo combinados con reaccionantes químicos adicionales que reaccionan para formar moléculas activas en Raman;

3. reaccionantes activos en Raman que interaccionan químicamente con el componente biológico; y

4. reaccionantes químicos que se convierten por el componente biológico en una molécula activa en Raman.

También se contempla que en lugar de empezar con una combinación de componente biológico/anticuerpo como en los ejemplos 1 y 2 anteriores, los procedimientos de detección Raman pueden usar productos químicos que interaccionan con el componente biológico sin el anticuerpo como se describe en los ejemplos 3 y 4 anteriores.

También se contempla que se pueden usar parejas de unión específicas para el componente biológico objetivo distintas de los anticuerpos, por ejemplo, un receptor biológico (una proteína).

Aunque las técnicas descritas en el presente documento están asociadas con la detección de organismos y componentes biológicos, se contemplan técnicas similares para la detección de componentes inorgánicos, componentes orgánicos, contaminantes o toxinas en una muestra. La potenciación adicional de las técnicas de detección descritas implica la elección de reaccionantes que presentan dispersión de luz de resonancia Raman. En otras palabras, hay frecuencias con más intensidad en la luz dispersada que es específica de la estructura del reaccionante. El fenómeno de resonancia en todas las realizaciones de la presente invención está relacionado solamente con la estructura química e interacción, y no con ninguna interacción con una superficie sólida, como se encuentra en la técnica conocida como Dispersión de resonancia Raman amplificada por superficie (SERRS) que es un procedimiento más complejo y menos deseable.

También se contempla que las realizaciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar un organismo o componente biológico en una muestra, que comprende:

a) proporcionar una pareja de unión específica para el organismo o componente biológico, en el que la pareja de unión específica está unida a una superficie sólida;

b) proporcionar uno o más reaccionantes que se unirán a la combinación del organismo o componente biológico y la pareja de unión específica, en el que el uno o más reaccionantes comprenden una o más enzimas que convierten uno o más reaccionantes en uno o más productos activos en Raman; y

c) decantar y lavar para separar el organismo, componente biológico o reaccionante no unidos; y

d) detectar el uno o más productos activos en Raman con un subsistema de detección que usa la dispersión de luz Raman, y

en el que la dispersión de luz Raman no es dispersión por interacción con una superficie sólida.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uno o más reaccionantes comprenden un anticuerpo contra el organismo o compuesto biológico objetivo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la dispersión de luz Raman es dispersión de resonancia Raman.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el subsistema de detección incluye un láser.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el láser se selecciona para tener una longitud de onda que corresponde a una longitud de onda de absorción del producto activo en Raman.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el láser tiene una salida en la región visible.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el láser tiene una salida a 532 nm.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el organismo o componente biológico es una bacteria.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la bacteria es Listeria.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el organismo o componente biológico es un virus.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el organismo o componente biológico se elige de una proteína, un metabolito, una hormona y un producto intermedio metabólico.

12. Un procedimiento para detectar Listeria en una muestra, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo específico para Listeria unido a una superficie sólida, en el que el anticuerpo específico para Listeria se diseña para que reaccione con y quede unido a cualquier Listeria presente en la muestra; b) proporcionar un segundo anticuerpo que comprende una o más enzimas que convierten uno o más reactivos en

uno o más productos activos en Raman; c) incubar la muestra y el anticuerpo mezclados para aumentar la concentración de Listeria unida; d) decantar y lavar para eliminar el organismo, componente biológico o segundo anticuerpo no unidos; y e) detectar el uno o más productos activos en Raman con un subsistema de detección que usa la dispersión de luz

Raman para detectar la concentración de Listeria unida, y en el que la dispersión de luz Raman no es amplificada por una superficie.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el subsistema de detección incluye un láser y en el

que el láser tiene una salida a 532 nm.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la una o más enzimas comprenden peroxidasa.

5 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el uno o más reactivos se eligen de ácido 5aminosalicílico, 4-aminoantipireno, alcohol 2-hidroxibencílico, 4-cloro-1-naftol, fenol, ácido 4,5-dihidroxinaftaleno-2,7disulfónico, ácido L-ascórbico, urea-peróxido de hidrógeno, y peróxido de hidrógeno, y preferiblemente en el que el uno o más reactivos comprenden ácido 5-aminosalicílico, alcohol 2-hidroxibencílico, ácido L-ascórbico y ureaperóxido de hidrógeno.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que uno de los productos activos en Raman es una iminoquinona.