COMPOSICIÓN Y PROCEDIMIENTOS PARA OBTENER ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE ESPUTO.

Un procedimiento de conservación de ADN contenido en esputo que comprende las etapas de:

a. obtener esputo a partir de un sujeto, b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende un agente quelante y un agente desnaturalizante, en el que el pH de dicha composición es mayor de 5,0, formando una disolución que contiene ADN; y c. almacenar dicho ADN a temperatura ambiente, en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo constituido por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y kits para conservar ácidos nucleicos a temperatura ambiente durante periodos prolongados de tiempo y para simplificar el aislamiento de ácidos nucleicos. 5

El ADN puede extraerse virtualmente de cualquier tipo de célula del cuerpo humano, con la excepción de eritrocitos. La fuente habitual de muestras corporales para la extracción del ADN es la sangre venosa, puesto que el número de leucocitos nucleados (principalmente neutrófilos y linfocitos) es relativamente alto y bastante consistente: el intervalo normal es de aproximadamente 5 a 10 millones de leucocitos por ml de sangre. El contenido de ADN de las células humanas es de aproximadamente 6 µg por millón de células, así que 1 ml puede proporcionar 10 teóricamente de 30 a 60 µg de ADN. Sin embargo, hay aproximadamente 5.000 millones de eritrocitos por ml de sangre que, puesto que no contienen ADN, deben retirarse para obtener ADN puro. Además, el uso de la sangre como fuente de ADN tiene muchas otras desventajas. La recogida de sangre no es un procedimiento trivial. La toma de sangre venosa requiere personal adiestrado. Es un procedimiento invasivo, que frecuentemente causa cierta incomodidad y dolor al donante. Son necesarias precauciones para minimizar la exposición del personal a 15 patógenos de transmisión hemática. Una vez recogida, la muestra de sangre debe congelarse o transportarse rápidamente a un laboratorio para la extracción de ADN. Por estas razones, la sangre venosa no es la fuente ideal de ADN. Un procedimiento más sencillo para obtener sangre es recoger unas pocas gotas después de una punción de dedo y transferirlas a un trozo de papel de filtro. Requiere personal menos adiestrado. Una vez secado, el ADN es bastante estable. La cantidad de ADN recuperada es pequeña pero suficiente para muchos fines forenses. Sin 20 embargo, una punción de dedo sigue siendo un procedimiento invasivo y el hemoderivado de la hemoglobina de la sangre puede inhibir algunos tipos de análisis de ADN.

Realizar un frotis del interior de la mejilla con una torunda (frotis bucal) es otra fuente de células que contienen ADN. Es mucho menos invasivo que la toma de sangre y puede recogerse por individuos con menos adiestramiento que el necesario en la recogida de sangre. Una vez recogido, el tiempo en que puede recuperarse el 25 ADN utilizable puede prolongarse secando el frotis o pasándolo sobre papel de filtro y secándolo. Sin embargo, como el interior de la boca no es una fuente estéril (en comparación con la sangre), los microbios pueden degradar la calidad del ADN después de un periodo de tiempo. El número de células recuperadas mediante este procedimiento no es grande y típicamente pueden esperarse menos de 1-2 µg de ADN en toda la muestra.

La saliva es un fluido incoloro bastante transparente secretado principalmente por las glándulas salivares 30 mayores (parótida, submandibular y sublingual). Su función es lubricar y limpiar la cavidad oral, así como iniciar el proceso de digestión. La glándula parótida secreta principalmente saliva serosa (acuosa), mientras que las demás glándulas secretan una mezcla de saliva serosa y mucinosa (pegajosa). Los componentes de la saliva incluyen albúmina, globulina, mucinas y enzimas digestivas. Se sabe desde hace mucho tiempo que el ADN celular está presente en la saliva y que este ADN es adecuado con fines forenses. El uso forense está limitado típicamente a la 35 identificación de víctimas o sospechosos, usando las pequeñas cantidades de ADN de la saliva que pueden recuperarse de un lugar del delito o de la parte posterior de un sello de correos. La noción de que la saliva puede ser una fuente fiable de ADN genómico y un rival para las muestras de sangre venosa se ha investigado con este fin más recientemente en una publicación científica (van Schie y col., J. Immunol. Methods 208: 91-101, 1997). Los autores usaron muestras de saliva recién recogidas o congeladas y purificaron el ADN mediante un procedimiento 40 de extracción bastante complejo. Las estimaciones de la cantidad de ADN recuperado se basaron en la absorción de luz a 260 nm, un procedimiento conocido por ser un procedimiento poco fiable, puesto que otras macromoléculas biológicas comunes, tales como ARN, tienen esencialmente el mismo espectro de absorción de luz ultravioleta. No obstante, estos autores mostraron que de hecho estaba presente ADN genómico de calidad mediante análisis electroforético en gel y análisis por reacción en cadena de la polimerasa para ciertos polimorfismos alélicos. Otra 45 comunicación (Terasaki, y col., Hum. Immunol. 59: 597-598, 1998) notificó resultados similares sobre la idoneidad de la saliva como fuente de ADN para el tipado de HLA mediante análisis por reacción en cadena de la polimerasa. Aunque se notificó la cantidad de ADN recuperado, el procedimiento usado para medir el ADN no. Estos autores proporcionaron 3 ejemplos en que la saliva secada sobre papel de filtro proporcionaba ADN adecuado para análisis.

Con el uso creciente de análisis basados en ADN en criminología, seguridad pública, defensa, medicina 50 humana, medicina veterinaria e investigación, existe la necesidad de un producto que permita convertir a la saliva en una fuente fiable estándar de ADN a partir de un individuo (para reemplazar a la sangre, el estándar actual). En criminología, defensa y situaciones de emergencia masiva, por ejemplo, se toman ahora muestras de ADN rutinariamente de personas vivas que se cree que son parientes de víctimas no identificadas de accidentes o asesinatos, para ayudar a la identificación de los muertos. El personal militar u otros individuos que se espera que se 55 encuentren en situaciones peligrosas en que sus vidas puedan estar en riesgo pueden desear almacenar muestras de ADN antes de exponerse a estos riesgos. En el campo de la seguridad pública, a los criminales convictos tanto en Canadá como en Estados Unidos se les exige ahora proporcionar muestras de ADN. Se espera que las pruebas basadas en ADN aumenten en medicina, tales como ensayos para fibrosis quística, isotipos del citocromo P450, polimorfismos que afectan a la susceptibilidad a enfermedades infecciosas y autoinmunes, tipado de HLA y 60

problemas de paternidad, por nombrar algunos. En estudios clínicos, un ejemplo sería cribar en poblaciones los genes de predisposición al cáncer de colon o, en miembros de la familia de una víctima de cáncer de mama, los genes de predisposición al cáncer de mama. En todos estos casos, hay ventajas significativas en proporcionar una muestra de saliva en lugar de proporcionar una muestra de sangre como fuente de ADN. Todos los donantes preferirían donar saliva en lugar de sangre debido a la incomodidad, dolor o aprensión asociados a la flebotomía o 5 punciones. La saliva tiene la ventaja adicional de no requerir personal especializado, reduciendo así el coste cuando se lleva a cabo una recogida de muestras masiva. El riesgo de infección con transmisión hemática se reduce igualmente.

Además del problema de desarrollar un procedimiento estándar de recogida y conservación de ADN en la saliva, permanece la necesidad continua de mejorar los procedimientos para superar problemas específicos de la 10 recuperación de ácidos nucleicos de la saliva. El problema de la extracción de ADN y ARN de alto peso molecular de células de mamífero se ha planteado parcialmente por Birnboim en Methods of Enzymology 216: 154-160, 1993, pero este trabajo no se extendía a la recuperación de ácidos nucleicos de fluidos corporales que contienen mucina.

El documento WO 98/44158 da a conocer procedimientos de recogida de analitos de ácido nucleico y no nucleico de muestras orales. Los procedimientos implican la conservación del ADN usando agentes quelantes y 15 detergentes.

Las proteínas multiméricas llamadas mucinas son proteínas glucosiladas de alto peso molecular que forman la mayor parte de la biopelícula protectora en la superficie de células epiteliales, donde pueden proporcionar una barrera para el material particulado y se unen a microorganismos. Estas glucoproteínas contribuyen en gran medida a la naturaleza viscoelástica de la saliva. La mucina de alto peso molecular principal en las secreciones salivares es 20 MUC5B, una de las cuatro mucinas formadoras de gel que existen como proteínas multiméricas, con pesos moleculares mayores de 20-40 millones de Da. La MLTC5B es una mucina oligomérica grande compuesta por subunidades ligadas por disulfuro.

Es conocido que los reactivos que reducen los disulfuros reducen también la viscosidad de la mucina, tal como la encontrada... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de conservación de ADN contenido en esputo que comprende las etapas de:

a. obtener esputo a partir de un sujeto,

b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende un agente quelante y un agente desnaturalizante, en el que el pH de dicha composición es mayor de 5,0, formando una disolución que contiene ADN; y 5

c. almacenar dicho ADN a temperatura ambiente,

en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo constituido por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho esputo es saliva. 10

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho esputo es de un mamífero.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho ADN es de un virus o una bacteria.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho ADN es estable durante más de 14 días, más de 30 días, más de 60 días o más de 360 días.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho agente desnaturalizante se selecciona de 15 dodecilsulfato de sodio y un alcohol, en el que dicho alcohol es un 10-60% de la composición total.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de recuperar dicho ADN poniendo en contacto dicha disolución que contiene ADN con una proteasa, opcionalmente en el que la proteasa está en forma desecada.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha proteasa es proteinasa K. 20

9. Un kit para conservar ADN a temperatura ambiente, comprendiendo dicho kit:

a. una composición que comprende un agente desnaturalizante y un agente quelante; seleccionado del grupo constituido por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina, en el que el pH de dicha composición es mayor de 5,0; y 25

b. un recipiente que comprende una primera región para recoger una muestra de dicho ADN y, separada por una barrera desestabilizable de dicha primera región, una segunda región para contener dicha composición.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que dicha composición es una disolución acuosa.

11. El kit de la reivindicación 9, en el que dicha composición comprende adicionalmente un agente reductor.

12. El kit de la reivindicación 9, en el que dicho agente desnaturalizante se selecciona del grupo constituido por: 30 urea, una sal de dodecilsulfato, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, perclorato y un alcohol, siendo dicho alcohol un 10-60% del volumen de composición total.

13. El kit de la reivindicación 9, en el que dicho agente desnaturalizante es dodecilsulfato de sodio.

14. El kit de la reivindicación 12, en el que dicho alcohol se selecciona del grupo constituido por: metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, trifluoroetanol, fenol y 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol. 35

15. El kit de la reivindicación 11, en el que la concentración de dicho agente reductor es mayor o igual a 50 mM.

16. El kit de la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor es un secuestrante de radicales libres antioxidante.

17. El kit de la reivindicación 16, en el que dicho secuestrante de radicales libres se selecciona del grupo de 40 compuestos constituido por: una vitamina antioxidante, una hormona antioxidante, una enzima antioxidante, un tiol y un fenol.

18. El kit de la reivindicación 11, en el que el agente reductor se selecciona del grupo constituido por ácido ascórbico, ditionito, eritorbato, N-acetilcisteína, cisteína, glutatión, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, dieritritol, un tiol soportado en resina, una fosfina soportada en resina, vitamina E y Trolox o sales de los mismos. 45

19. El kit de la reivindicación 9, en el que dicho agente quelante inhibe el ciclo rédox de metales.

20. El kit de la reivindicación 9, en el que dicho pH está entre 5,0 y 11,0 inclusive, entre 6,5 y 7,5 inclusive, o es de aproximadamente 7,0.

21. El kit de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un agente antimicrobiano.

22. El kit de la reivindicación 21, en el que dicho agente antimicrobiano comprende un alcohol. 5

23. El kit de la reivindicación 22, en el que dicho alcohol es etanol.

24. El kit de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un inhibidor de ribonucleasa.

25. El kit de la reivindicación 24, en el que dicho inhibidor se selecciona del grupo constituido por heparina, sulfato de heparano, ácido oligo(vinilsulfónico), ácido poli(vinilsulfónico), ácido oligo(vinilfosfónico) y ácido poli(vinilsulfúrico) o sales de los mismos. 10

26. El kit según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente una proteasa para recuperar dicho ADN, estando opcionalmente dicha proteasa en forma secada.

27. El kit según la reivindicación 26, en el que dicha proteasa es proteinasa K.

28. Un procedimiento de conservación de ADN en un fluido corporal o tejido que contiene mucina y de reducción de la viscosidad de dicho fluido corporal o tejido que contiene mucina, que comprende las etapas de 15

a. obtener esputo a partir de un sujeto;

b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende un agente quelante y un agente desnaturalizante, en el que

el pH de dicha composición es mayor de 5,0 cuando se pone en contacto con dicho esputo, formando una disolución que contiene ADN; y 20

c. almacenar dicho ADN a temperatura ambiente;

en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo constituido por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicho ADN es estable durante más de 14 días, más 25 de 30 días, más de 60 días o más de 360 días.

30. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicho fluido corporal es esputo.

31. El procedimiento de la reivindicación 28, que comprende adicionalmente la recuperación de dicho ADN.

32. Un procedimiento de recuperación de ADN de esputo que comprende las etapas de:

a. obtener esputo a partir de un sujeto; 30

b. conservar el ADN en dicho esputo usando el kit según la reivindicación 26, poner en contacto dicho esputo con la composición formando una mezcla y poner en contacto la mezcla con la proteasa en forma desecada; y

c. recuperar dicho ADN de dicha mezcla.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicho esputo es saliva. 35

34. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicho esputo es de un mamífero.

35. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicha proteasa es proteinasa K o pronasa.

36. Uso de una composición para conservar el ADN de una muestra de esputo a temperatura ambiente, en el que dicha composición comprende un agente quelante y un agente desnaturalizante y tiene un pH mayor de 5,0 cuando se pone en contacto con dicho esputo, y en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo constituido 40 por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina.

37. El uso según la reivindicación 36, en el que dicho ADN es estable durante más de 14 días, más de 30 días, más de 60 días o más de 360 días.

38. El uso según la reivindicación 36, en el que la composición comprende adicionalmente un agente reductor.

39. El uso según la reivindicación 36, en el que dicho agente desnaturalizante se selecciona de dodecilsulfato de sodio y un alcohol, en el que dicho alcohol es un 10-60% de la composición total.

40. El uso según la reivindicación 36, en el que dicha composición comprende adicionalmente una proteasa para recuperar dicho ADN. 5

41. El uso según la reivindicación 40, en el que dicha proteasa es proteinasa K.

42. Un procedimiento de conservación de ADN contenido en esputo a temperatura ambiente que comprende las etapas de:

a. obtener esputo a partir de un sujeto; y

b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende LiCl 0,67 M, TRIS-HCI 33 mM, 10 urea 0,67 M, 0,6% de SDS, CDTA 3,3 mM, 30% (v/v) de etanol, en el que el pH de dicha composición es 8,0; y

c. mezclar dicha disolución que contiene ADN con una proteasa.

43. Un procedimiento de conservación de ADN contenido en esputo a temperatura ambiente que comprende las etapas de:

a. obtener esputo a partir de un sujeto; y 15

b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende NaOAc 0,5 M, TRIS-HCI 0,2 M, CDTA 10 mM 1% de SDS, 30% (v/v) de etanol, en la que el pH de dicha composición es de 9,5; y

c. mezclar dicha disolución que contiene ADN con una proteasa.

44. Un procedimiento de conservación de ADN contenido en esputo a temperatura ambiente que comprende las etapas de: 20

a. obtener esputo a partir de un sujeto; y

b. poner en contacto dicho esputo con una composición que comprende NaOAc 0,5 M, TRIS-HCl 0,2 M, ascorbato de sodio 0,15 M, CDTA 10 mM, 1% de SDS, 30% (v/v) de etanol, en la que el pH de dicha composición es de 9,5; y

c. mezclar dicha disolución que contiene ADN con una proteasa. 25

45. El procedimiento según la reivindicación 42, 43 o 44, en el que dicho ADN es estable durante más de 14 días, más de 30 días, más de 60 días o más de 360 días.

46. Una composición para conservar ADN a temperatura ambiente que comprende un agente desnaturalizante y un agente quelante seleccionado del grupo constituido por ciclohexanodiaminotetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido 30 tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA) y desferrioxamina,

en la que el pH de dicha composición es mayor de 5,0.

47. La composición de la reivindicación 46, en la que dicha composición es una disolución acuosa.

48. La composición de la reivindicación 46, en la que dicha composición comprende adicionalmente un agente reductor. 35

49. La composición de la reivindicación 46, en la que dicho agente desnaturalizante se selecciona del grupo constituido por: urea, una sal de dodecilsulfato, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, perclorato y un alcohol, siendo dicho alcohol un 10-60% del volumen de composición total.

50. La composición de la reivindicación 46, en la que dicho agente desnaturalizante es dodecilsulfato de sodio.

51. La composición de la reivindicación 49, en la que dicho alcohol se selecciona del grupo constituido por 40 metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, trifluoroetanol, fenol y 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol.

52. La composición de la reivindicación 48, en la que la concentración de dicho agente reductor es mayor o igual a 50 mM.

53. La composición de la reivindicación 48, en la que dicho agente reductor es un secuestrante de radicales libres antioxidante, en la que dicho secuestrante de radicales libres antioxidante se selecciona opcionalmente del 45

grupo de compuestos constituido por: una vitamina antioxidante, una hormona antioxidante, una enzima antioxidante, un tiol y un fenol.

54. Una composición de la reivindicación 48, en la que el agente reductor se selecciona del grupo constituido por: ácido ascórbico, ditionito, eritorbato, N-acetilcisteína, cisteína, glutatión, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, dieritritol, un tiol soportado en resina, una fosfina soportada en resina, vitamina E y Trolox, o sales de los mismos. 5

55. La composición de la reivindicación 46, en el que dicho agente quelante inhibe ciclos rédox de metales.

56. La composición de la reivindicación 46, en la que dicho pH está entre 5,0 y 11,0 inclusive, entre 6,5 y 7,5 inclusive o es de aproximadamente 7,0.

57. La composición de la reivindicación 46, que comprende adicionalmente:

(a) un agente antimicrobiano; en el que dicho agente antimicrobiano comprende opcionalmente un alcohol, 10 y preferiblemente en el que dicho alcohol es etanol; o

(b) un inhibidor de ribonucleasa; en el que dicho inhibidor se selecciona opcionalmente del grupo constituido por heparina, sulfato de heparano, ácido oligo(vinilsulfónico), ácido poli(vinilsulfónico), ácido oligo(vinilfosfónico) y ácido poli(vinilsulfúrico) o sales de los mismos.