Una composición que comprende: a) de 0,1 a 10% en peso de quitosano en una disolución acuosa transparente y ácida de quitosano,

en la que dicho quitosano tiene un grado de desacetilación entre 70% y 100%; b) de 0,1 a 20% en peso de por lo menos un agente tampón que tiene un pKa entre 6,0 y 7,6, y c) de 0,01 a 10% en peso de por lo menos un reactivo que reacciona con grupos amino del quitosano, en la que dicha composición de quitosano N-modificado tiene un pH que varía de 6,8 a 7,2, y dicho quitosano sufre una Nmodificación, N-injerto o N-reticulación homogénea en dicha composición de quitosano; siendo seleccionado dicho reactivo del grupo que consiste en glutaraldehído, formaldehído, anhídrido acético, anhídrido propiónico, anhídrido butírico, un reactivo basado en aldehído propiónico bifuncional, un reactivo que tiene un grupo éster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo éster de sulfosuccinimidilo y N-sulfosuccinimidilo, reactivo que tiene un grupo imidoéster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo di-metilpimelimidato, dimetiladipimidato, di-metilsuberimidato, y di-metilpropionimidato, y un reactivo que tiene un grupo fenilazida, hidrazida, hidrofenilazida o nitrofenilazida en la que dicha composición no comprende un disolvente orgánico

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método para modificar químicamente quitosano, que incluye N-substitución o Nreticulación, en condiciones homogéneas proporcionando disoluciones acuosas neutras de quitosano con reactividad mejorada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El quitosano es un aminopolisacárido obtenido por desacetilación alcalina de quitina, un polisacárido natural que se encuentra en los exoesqueletos de mariscos e insectos. La quitina no se puede disolver en agua excepto en disoluciones acuosas concentradas de ácido mineral, durante cuya disolución hay una disminución del grado de polimerización y probablemente la retirada de algunos grupos acetilo. Tales características han limitado indudablemente su investigación y utilización en muchos campos, a pesar de las ventajas reivindicadas para la quitina y su gran abundancia en la naturaleza. En contraste, las numerosas aplicaciones industriales reivindicadas para el quitosano, se atribuyen en particular a su buena solubilidad en medio ácido suave, vía la formación de grupos amonio.

Convencionalmente, el quitosano se disuelve en medio ácido acuoso y se puede mantener en disolución hasta un pH cercano a 6,2 (justo por debajo de su pKa de 6,3). En estas condiciones, la reactividad del quitosano está significativamente, disminuida debido a la predominancia de los grupos NH3+ no reactivos comparada con los grupos NH2, y se sabe que los últimos son nucleófilos y por lo tanto susceptibles de reaccionar con distintos electrófilos debido a su par de electrones sin compartir. Sin embargo, se han empleado varios enfoques químicos para modificar homogéneamente quitosano en condiciones ácidas (pH<6), específicamente haciendo reaccionar aldehídos, cloruros de ácido, anhídridos de ácido y epóxidos, y similares con grupos amino del quitosano.

Para conseguir la modificación del quitosano en condiciones homogéneas, la técnica anterior cita la adición de un codisolvente orgánico (metanol, piridina, etc.) a la disolución de quitosano ácida, para mejorar la reactividad del quitosano (Patente de EE.UU. 4.996.307 y patente de EE.UU. 4.424.346) o el uso de un gran exceso de reactivo (Hirano et al., Biopolymers, 15, 168.5, 1976, Kubota et al., Polymer Journal, 29, 123, 1997). Sin embargo, la presencia de un codisolvente orgánico o un exceso de reactivo no es deseable para aplicaciones médicas. Además, los problemas medioambientales están proporcionando un fuerte incentivo para eliminar el disolvente orgánico y reducir el uso de reactivos. Además, a bajo pH (por debajo de 6,2) el número de grupos amino libres es insuficiente para permitir que el quitosano sufra una reacción con algunos reactivos electrófilos, particularmente los que llevan benzoimidato o grupos epoxi.

Todos los estudios relacionados con la N-substitución de quitosano confirman la importancia de la disponibilidad y activación de grupos amino no ionizados libres de quitosano. Una patente reciente (patente de EE.UU. No. 5.977.330) reivindica la N-substitución de quitosano con buen rendimiento vía una alta activación de grupos amino libres de quitosano controlando dos factores que mejoran la reactividad del quitosano, a saber, el pH neutro y el uso de un disolvente orgánico. Sin embargo, además de un disolvente orgánico, la reacción se realizó heterogéneamente sobre quitosano no precipitado debido a la imposibilidad de mantener quitosano en disolución en condiciones de pH neutro, cuando se usan disoluciones alcalinas convencionales tales como NaOH o NH4OH como agentes neutralizantes.

La patente de EE.UU. 5.489.401 (otorgada el 6 de febrero de 1996) describe la encapsulación de materiales activos en bolas de quitosano.

La publicación de Aiba (Makromolekulare Chemie, vol. 194, 1993, pp. 65-75) describe la reactividad del grupo amino de quitosano parcialmente N-acetilado que tiene un grado de acetilación de 56% y 51%.

La publicación de Chenite et al. (Carbohydrate Research, vol 46, 2001, pp, 39-47) describe la caracterización reológica de disoluciones termogelificantes de quitosano/fosfato de glicerol.

La patente de EE.UU. 4.996.307 (otorgada el 26 de febrero de 1991) describe la preparación de un quitosano acilado soluble en agua que tiene un grado de acilación de 35 a 65% en presencia de un gran exceso de disolvente orgánico tal como metanol, etanol o isopropanol.

El documento WO 02/40070 (publicado el 23 de mayo de 2002) describe un método para restaurar un disco intervertebral degenerado o dañado en una fase temprana.

Sería muy deseable que se proporcionase un método alternativo para modificar o reticular homogéneamente quitosano, proporcionando una disolución acuosa de quitosano, que se pueda mantener bastante en disolución en la cercanía de pH neutro, dado que en tales condiciones el número y la reactividad de los grupos amino libres se mejoran considerablemente.

También sería muy deseable que se proporcionase un método alternativo que permitiera la eliminación de disolvente orgánico y previniera el uso de un exceso de reactivo, y sin embargo aún diera posibles reacciones entre quitosano y grupos funcionales electrófilos, que usualmente requiere pH neutro para que ocurra.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo método para la modificación química, que incluyen la N-substitución o la N-reticulación de quitosano, en condiciones homogéneas proporcionando disoluciones acuosas neutras de quitosano con aminoreactividad mejorada.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo método para la modificación química o la N-reticulación de quitosano, en condiciones homogéneas que evitarían el uso de disolvente orgánico o un gran exceso de reactivo.

Recientemente, los inventores encontraron varios tampones, que permiten la neutralización de disolución de quitosano hasta pH neutro o casi neutro sin inducir la precipitación inmediata de un tipo de gel. Con estos tampones, las reacciones homogéneas que implican grupos amino de quitosano se pueden realizar en estas condiciones, sin la necesidad de un codisolvente orgánico (metanol, piridina, etc.) o exceso de reactivo.

Someter el quitosano neutralizado a cualquier reacción con electrófilos en disolución homogénea, conduce a mejoras en rendimiento y calidad del producto final, que es el quitosano modificado.

El método y composición de la presente invención de este modo permite la eliminación de disolvente orgánico y catalizador orgánico, y permite la reducción de reactivo, usualmente implicados en la modificación química de quitosano, mejorando el rendimiento y calidad del producto final, esto es el quitosano modificado.

Según la presente invención, se proporciona de este modo una composición que comprende:

a) De 0,1 a 10% en peso de quitosano en una disolución acuosa transparente y ácida de quitosano, en la que dicho quitosano tiene un grado de desacetilación entre 70% y 100%;

b) De 0,1 a 20% en peso de por lo menos un agente tampón que tiene un pKa entre 6,0 y 7,6, y

c) De 0,01 a 10% en peso de por lo menos un reactivo que reacciona con los grupos amino del quitosano, en el que dicha composición de quitosano N'-modificado tiene un pH resultante que varía de 6,8 a 7,2, y dicho quitosano sufre una N-modificación, N-injerto o N-reticulación homogénea en dicha composición de quitosano; siendo seleccionado dicho reactivo del grupo que consiste en glutaraldehído, formaldehído, anhídrido acético, anhídrido propiónico, anhídrido butírico, un reactivo basado en aldehído propiónico bifuncional, un reactivo que tiene un grupo éster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo éster de sulfo-succinidimilo y Nsulfo-succinidimilo, reactivo que tiene un grupo reactivo imidoéster seleccionado del grupo que consiste en grupo di-metilpimelimidato, di-metiladipimidato, di-metilsuberimidato, y di-metilpropionimidato, y un reactivo que tiene grupo fenilazida, hidrazida, hidroxifenilazida o nitrofenilazida.

en la que dicha composición no comprende un disolvente orgánico.

Aún según el método de la presente invención, se proporciona un método para modificar químicamente o reticular quitosano en condiciones homogéneas, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) Preparar una disolución acuosa transparente de quitosano, comprendiendo... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

a) de 0,1 a 10% en peso de quitosano en una disolución acuosa transparente y ácida de quitosano, en la que dicho quitosano tiene un grado de desacetilación entre 70% y 100%;

b) de 0,1 a 20% en peso de por lo menos un agente tampón que tiene un pKa entre 6,0 y 7,6, y

c) de 0,01 a 10% en peso de por lo menos un reactivo que reacciona con grupos amino del quitosano, en la que dicha composición de quitosano N-modificado tiene un pH que varía de 6,8 a 7,2, y dicho quitosano sufre una N-modificación, N-injerto o N-reticulación homogénea en dicha composición de quitosano; siendo seleccionado dicho reactivo del grupo que consiste en glutaraldehído, formaldehído, anhídrido acético, anhídrido propiónico, anhídrido butírico, un reactivo basado en aldehído propiónico bifuncional, un reactivo que tiene un grupo éster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo éster de sulfosuccinimidilo y N-sulfosuccinimidilo, reactivo que tiene un grupo imidoéster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo di-metilpimelimidato, dimetiladipimidato, di-metilsuberimidato, y di-metilpropionimidato, y un reactivo que tiene un grupo fenilazida, hidrazida, hidrofenilazida o nitrofenilazida

en la que dicha composición no comprende un disolvente orgánico.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho agente tampón es un tampón biológico de cultivo celular.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho tampón biológico de cultivo celular se selecciona del grupo que consiste en sales de fosfato, sales de glicerofosfato; ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO); ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(4butanosulfónico) (HEPBS); ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES); ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES); ácido 4-(N-morfolino)butanosulfónico (MOBS); ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS); ácido β-hidroxi-4morfolinopropanosulfónico (MOPSO); 2-bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (BIS-TRIS); y 1,3bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano (BIS-TRIS propano), o una de sus mezclas.

4. La composición de la reivindicación 1, que consiste adicionalmente en un agente farmacéutico, un agente terapéutico

o un agente bioactivo.

5. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente células.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que las células son células de mamífero vivas.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha composición consiste adicionalmente en un material de origen biológico, tal como autoinjerto, aloinjerto, xenoinjerto, hueso molido, polvo de hueso desmineralizado, proteínas sólidas animales o humanas, células vivas animales o humanas.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha composición consiste adicionalmente en un material cerámico

o inorgánico.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que dicho material cerámico o inorgánico es bioglas, fosfato de calcio, sulfato de calcio, o carbonato de calcio.

10. Un método para modificar químicamente o reticular quitosano en condiciones homogéneas, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) preparar una disolución acuosa transparente de quitosano, comprendiendo dicha disolución (i) de 0,1 a 10% en peso de un quitosano que tiene un grado de desacilación entre 70% y 100%, y (ii) de 0,1 a 20% en peso de por lo menos un agente tampón que tiene un pKa entre 6,0 y 7,6, teniendo dicha disolución un pH que varía de 6,4 a 7,2; y

b) disolver homogéneamente por lo menos un reactivo en la disolución de la etapa a), reaccionando dicho reactivo con grupos amino del quitosano, y estando dicho reactivo en una concentración de 0,01 a 10% en peso, en el que dicho agente reactivo se selecciona del grupo que consiste en glutaraldehído, formaldehído, anhídrido acético, anhídrido propiónico, anhídrido butírico, un reactivo basado en aldehído propiónico bifuncional, un reactivo que tiene un grupo éster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo éster de sulfosuccinimidilo y N-sulfosuccinimidilo, reactivo que tiene un grupo imidoéster reactivo seleccionado del grupo que consiste en grupo di-metilpimelimidato, di-metiladipimidato, di-metilsuberimidato, y di-metilpropionimidato, y un reactivo que tiene un grupo fenilazida, hidrazida, hidrofenilazida o nitrofenilazida,

en el que dicho quitosano en la disolución acuosa está químicamente modificado o reticulado por una substitución selectiva en el grupo amino de quitosano; y en el que no están implicados disolventes orgánicos en la preparación de dicho quitosano químicamente modificado o reticulado.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente la etapa de purificar el quitosano químicamente modificado o reticulado.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la etapa de purificación consiste en: a) dializar el quitosano químicamente modificado o reticulado;

5 b) precipitar el quitosano obtenido en la etapa c), con una disolución básica; c) lavar el quitosano precipitado de la etapa d); y d) secar al aire el quitosano lavado de la etapa e).

13. El método de la reivindicación 10, en el que dicho agente tampón es un tampón biológico de cultivo celular.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el tampón biológico de cultivo celular se selecciona del grupo que

10 consiste en sales de fosfato, sales de glicerofosfato, ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO); ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-4-butanosulfónico (HEPBS); ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES); ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES); ácido 4(N-morfolino)butanosulfónico (MOBS); ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS); ácido β-hidroxi-4morfolinopropanosulfónico (MOPSO); 2-bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (BIS-TRIS); y 1,3bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano (BIS-TRIS propano), o una de sus mezclas.

15. El método de la reivindicación 10, en el que la disolución de la etapa a) comprende adicionalmente un agente farmacéutico, un agente terapéutico o un agente bioactivo.

16. El método de la reivindicación 10, en el que la disolución de la etapa a) comprende células suspendidas.

17. El método de la reivindicación 16, en el que las células suspendidas son células de mamífero vivas suspendidas.

20 18. El uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la producción in vitro de híbridos célula/polímero para ensayos in vitro.

19. El uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para producir un hidrogel de quitosano uniforme y homogéneo con pH fisiológico.