CÉLULAS MADRE DE TIPO BLASTÓMERO TOTIPOTENCIALES NO EMBRIONARIAS Y PROCEDIMIENTOS DE LAS MISMAS.

Esta solicitud reivindica prioridad sobre nuestras solicitudes de patente provisional de EE.UU. relacionadas de números de serie 60/606.913, presentada el 3 de septiembre de 2204, y 60/607.624, presentada el 8 de septiembre de 2004.

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere a células madre y reactivos para las mismas, y, es especialmente, en lo que se refiere a células madre no embrionarias totipotenciales.

Antecedentes de la invención

Células madre

Actualmente se piensa que las células de mamífero progresan desde los estadios de célula embrionaria a células completamente desarrolladas a través de una secuencia de células blastoméricas totipotenciales que se desarrollan en células epiblásticas pluripotenciales, que se desarrollan en células del linaje de la capa germinal, que dan lugar a células progenitoras multipotenciales que se convierten en células progenitoras tripotenciales, después bipotenciales, después unipotenciales y, por último, en los tipos de células diferenciadas.

Sorprendentemente, aunque la gran mayoría de las células progresa a través de dicha secuencia de desarrollo y diferenciación, unas pocas células se convierten en células precursoras de reserva que proporcionan un mantenimiento y reparación continuos del organismo. Las células precursoras de reserva conocidas localizadas en el individuo tras el nacimiento incluyen células madre de tipo epiblasto, células madre del linaje de la capa germinal (células madre del linaje de la capa germinal ectodérmica, células madre del linaje de la capa germinal u células madre del linaje de la capa germinal mesodérmica) y varias células progenitoras. En los últimos años, se ha prestado atención especial a las células en estadio temprano y, especialmente, a las células madre embrionarias.

Las células madre embrionarias (CME) son células no comprometidas que se aíslan de tejidos embrionarios. Por ejemplo, se han aislado CME del blastocisto, la masa celular interna y las crestas gonadales de embrión de ratón, conejo, rata, cerdo, oveja, primate y de ser humano (Evans y Kauffman, 1981; Iannaccone y coI., 1994; Graves y Moreadith, 1993; Martin, 1981; Notarianni y coI., 1991; Thomson, y coI., 1995; Thomson, y coI., 1998; Shamblott, y coI., 1998). Cuando se inyectan en los embriones, las CME pueden dar lugar a todos los linajes somáticos, así como a gametos funcionales (es decir, espermatozoides). Normalmente, las CME se diferencian de forma espontánea en medio definido sin suero en ausencia de agentes que inhiban la diferenciación (p. ej., factor inhibidor de leucemia). Otras preparaciones conocidas de células madre embrionarias de tejido embrioide, tejido posmórula, estadio de blastocisto y estadio pre-blastocisto se han descrito en la solicitud de patente de EE.UU. Nº 2003/0175955, los documentos EP 1 176 189, WO 1997/020035 y WO 1995/016770, respectivamente, No obstante, dichas preparaciones celulares son pluripotenciales y/o se aísla de un embrión, lo que plantea una controversia ética. Las células madre embrionarias bovinas totipotenciales se han notificado en la patente de EE.UU. nº 6.107.543 y en la patente de EE.UU. nº 6.703.209 se han descrito células madre formadoras de la línea germinal ungulada (posiblemente no totipotenciales)

En otros procedimientos también conocidos se han aislado células madre pluripotenciales de fuentes no embrionarias, incluida la matriz del cordón umbilical tal como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0161818 y de tejido gonadal posnatal, tal como se instruye en el documento 2002/031123. No obstante, aunque dichas células no requieren destrucción de un embrión y son, por tanto, de un potencial interés para las células madre humanas, no se ha demostrado que las células madre así aisladas sean totipotenciales.

Tras la diferenciación in vitro, todas o casi todas estas células expresan una amplia variedad de tipos celulares, incluidos gametos, así como células derivadas de los linajes de la capa germinal del ectodermo, el mesodermo y en endodermo. Por desgracia, cuando las células madre embrionarias no comprometidas conocidas actualmente se implantan en animales, normalmente se diferencian espontáneamente in situ, formando teratomas. Estos tumores contienen varios tipos de células y tejido derivados de los tres principales linajes de la capa germinal (Thomson y coI., 1988). Por tanto, aunque las CME parecen tener potencial terapéutico en terapias de transplante, su tendencia a diferenciarse de forma espontánea de un modo incontrolado limita su utilidad.

Propagación de las células madre

El medio de crecimiento para el crecimiento en cultivo de la mayoría de las células madre normalmente está suplementado con suero animal y/o humano para optimizar y potenciar la viabilidad celular. Los constituyentes del suero incluyen agua, aminoácidos, glucosa, albúminas, inmunoglobulinas y uno o más agentes bioactivos. Potenciales agentes bioactivos presentes en el suero incluyen agentes que inducen la proliferación, agentes que aceleran la expresión fenotípica, agentes que inducen la diferenciación, agentes que inhiben la proliferación, agentes que inhiben la expresión fenotípica y agentes que inhiben la diferenciación. Por desgracia, la(s) identida(des), concentración(es) y posibles combinaciones de agentes bioactivos específicos contenidos en diferentes lotes de suero es(son) desconocidos. Uno o más de estos agentes desconocidos en suero han mostrado un impacto negativo sobre el aislamiento, cultivo, crioconservación y purificación de células madre de tipo blastómero de linaje no comprometido. De forma similar, cuando se emplearon capas de alimentación para las células madre, con frecuencia se produce contaminación de los cultivos de células madre con componentes específicos de la capa de alimentación, especialmente virus.

Como alternativa, para cultivos celulares generales se conocen medios sin suero y determinadas células madre pluripotenciales se han propagado en dicho medio con una pluralidad de factores de crecimiento, tal como se describe en los documentos US20050164380, US20030073234, US6617159, US6117675 o EP1298202.

Por tanto, aunque en la técnica se conocen numerosas composiciones y procedimientos para células madre, todos o casi todos sufren una o más desventajas. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de mejores células madre, composiciones y reactivos para su producción, mantenimiento y diferenciación, y, especialmente, para células madre de tipo blastómero totipotenciales posnatales.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a composiciones y procedimientos relacionados con células madre de tipo blastómero totipotenciales que expresan telomerasa y portan marcadores de superficie CEA-CAM-1+, SSEA-1-, SSEA-3-, SSEA-4-, y, opcionalmente CD10-y CD66e+ (p. ej., cuando la célula procede de un ser humano).

En un aspecto de la materia sujeto de la invención, una célula madre aislada es, preferentemente, una célula madre de mamífero, posnatal, totipotencial que tiene los marcadores de superficie CD66e+, CEA-CAM-1+, CD10-, SSEA-1-, SSEA-3-y SSEA-4-. Dichas células se diferencian de forma ventajosa en una célula placentaria o una célula germinal tras la estimulación con un medio de diferenciación y se sabe que sufren al menos 100, más normalmente al menos 200, y más normalmente al menos 300 duplicaciones al tiempo que mantienen la naturaleza totipotencial en medio sin suero en ausencia de inhibidores de la diferenciación. Por tanto, las células de acuerdo con la materia sujeto de la invención normalmente no se diferenciarán de forma espontánea en medio sin suero en ausencia de inhibidores de la diferenciación, permanecerán quiescentes y no formarán un tejido canceroso cuando se implantan en un animal.

Dichas células pueden además caracterizarse por la expresión de Oct-3/4, Nanog, Nanos, BMI-1, IDE1, IDE3, ABCG2, CXCR-4, y/o BCL-2, y la falta de expresión de CD1 a, C02, CD3, CD4, CD5, CD7, COB, CD9, CD11 b, CD11 c, CD13, CD14, CD 15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD31, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD42b, CD45, CD49d, CD55, CD56, CD57, CD59, CD61, CD62E, CD65, CD68, CD69, CD71, CD79, CD83, CD90, CD95, CD1 05, CD1 06, CD117, CD123, CD135, CD166, Glicoforina-A, MHC-I, HLA-DRII, FMC-7, Anexina-V, y/o LIN. En otros aspectos adicionales contemplados, los inventores contemplan un procedimiento de aislar una célula madre en la que se recibe una pluralidad de células de un tejido de mamífero. A continuación, las células se cultivan más allá de la confluencia para obtener múltiples capas y se recogen. En otra etapa, las células recolectadas... [Seguir leyendo]

1. Una célula madre de tipo blastómero (CMTB) posnatal aislada de rata que tiene un tamaño inferior a 1 µm, que expresa un marcador de superficie CEA-CAM-1, y no expresa marcadores de superficie SSEA-1, SSEA-3 y SSEA-4 y positiva para azul tripán.

2. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula madre es una célula de mamífero que tiene el marcador de superficie CD66e y no CD10.

3. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula tiene potencia para diferenciarse en una célula placentaria o una célula germinal, tras estimulación con un medio de inducción.

4. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula tiene potencia para diferenciarse en una célula madre de tipo epiblasto, tras estimulación con un medio de inducción.

5. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula tiene potencia para diferenciarse en una célula madre de linaje de capa germinal ectodérmica tras estimulación con un medio de inducción específico ectodérmico.

6. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula tiene potencia para diferenciarse en una célula madre de linaje de capa germinal mesodérmica tras estimulación con un medio de inducción específico mesodérmico.

7. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula tiene potencia para diferenciarse en una célula madre de linaje de capa germinal endodérmica tras estimulación con un medio de inducción específico endodérmico.

8. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula sufre al menos 100 duplicaciones al tiempo que conserva su naturaleza totipotencial en un medio de propagación definido sin suero en ausencia de inhibidores de la diferenciación.

9. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula sufre al menos 300 duplicaciones al tiempo que conserva su naturaleza totipotencial en un medio de propagación definido sin suero en ausencia de inhibidores de la diferenciación.

10. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula no se diferencia de forma espontánea en medio de propagación definido sin suero en ausencia de inhibidores de la diferenciación.

11. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula permanece quiescente cuando se implanta en un animal y no forma un tejido canceroso.

12. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula se diferencia en un animal que tiene daños tisulares y no forma un tejido canceroso.

13. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula expresa al menos uno de telomerasa Oct-3/4, Nanog, Nanos, MI-1, DE1, IDE3, ABCG2, CXCR-4, y BCL-2, y en la que la célula no expresa al menos uno de CD1 a, CD2, CD3, D4, CD5, CD7, CDB, CD9, CD11 b, CD11 c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, D25, CD31, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD42b, CD45, CD49d, CD55, CD56, CD57, CD59, CD61, CD62E, D65, CD68, CD69, CD71, CD79, CD83, CD90, CD95, CD105, CD106, CD117, CD123, CD135, D166, Glicoforina-A, MHC-l, HLA-DRII, FMC-7, Anexina-V y LIN.

14. La célula madre de la reivindicación 1, en la que la célula expresa CEA-CAM-1, y telomerasa, y en la que la célula no expresa MHC-1.

15. Un procedimiento de aislar una célula madre de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(i) recibir una pluralidad de células de un tejido de rata;

(ii) cultivar las células más allá de la confluencia para obtener múltiples capas confluyentes y recolectar las células cultivadas;

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el tejido de rata es tejido conjuntivo y en el que las células madre tienen los marcadores de superficie CD66e+ y CD10-.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las células madre de linaje de la capa germinal se retiran

18. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las células madre de tipo epiblasto se retiran usando

anticuerpos específicos de al menos uno de CD1 0, SSEA-1, SSEA-3 y SSEA4. 5

19. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las células descongeladas se cultivan para aumentar el número de células antes de la etapa de retirar las células madre de linaje de capa germinal y las células madre de tipo epiblasto. 20. El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende una etapa de clonar las células madre que tienen marcadores de superficie CEACAM-1+, CD66e+, CD10-, SSEA-1-, SSEA-3-y SSEA-4-, para obtener, de este modo, poblaciones monoclonales de las células madre de acuerdo con la reivindicación 1.