Biosensor para la detección de anticuerpos anti-VIH.En la presente invención se provee un biosensor capaz de detectar anticuerpos anti-VIH en una muestra biológica,

basado en la utilización combinada de una enzima alostérica, modificada genéticamente, y una matriz con redes de microelectrodos

Biosensor para la detección de anticuerpos anti-VIH.

En la presente invención se provee un biosensor capaz de detectar anticuerpos anti-VIH en una muestra biológica, basado en la utilización combinada de una enzima alostérica, modificada genéticamente, y una matriz con redes de microelectrodos. Una de las ventajas de este biosensor es su alta sensibilidad, su sencillez en la detección y su portabilidad.

Estado de la técnica anterior

El diagnóstico puntual de enfermedades infecciosas es un elemento clave en el campo de la medicina clínica y veterinaria. En la actualidad se dedican grandes esfuerzos a la mejora de ensayos ya existentes, lo que permite la aparición de nuevos métodos de detección (Kuiken et al., 2003. Curr. Opin. Biotechnol., 14: 641-646), así como el descubrimiento de estrategias nuevas para asegurar una detección de infecciones con mejor sensibilidad, seguridad y eficacia (Iqbal et al., 2000. Biosens. Bioelectron., 15: 549-578; Domínguez E.A., 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 2286-2290; Lennette E. H. and Smith, 1999. Laboratory diagnosis of viral infections, Informa Health Care). En los 20 últimos años, el virus de la inmunodeficiencia Humana (VIH) ha sido uno de los virus más estudiados, y la diana principal en la concepción de nuevos procesos analíticos (McDougal, 2001. AIDS Rev., 3: 183-193), directos o indirectos según se utilice como diana el virus o los anticuerpos dirigidos contra él. En el primer caso, los componentes virales (por ejemplo ácidos nucleicos o proteínas) se pueden detectar mediante ELISA-antigénico (Schüpbach et al., 2000. Int. J. Antimicrob. Agents, 16: 441-445), o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Marie Louie, 2000. CMAJ, 163: 301-309; Elnifro et al., 2000. Clin. Microbiol. Rev., 13: 559-570; Ballagi-Pordany, 1993. Vet. Res. Commun., 17: 55-72; Niesters, 2004. Clinical Microbiology Infect., 10: 5-11; Hjelle and Busch, 1989. Arch. Pathol. Lab. Med., 113: 975-980). Los métodos indirectos demuestran la presencia de anticuerpos anti-virales, siendo los más comunes del tipo anticuerpo-Elisa, Western blot (Steckelberg and Cockerill, 1998. Mayo Clin. Proc., 63: 373-380) u otros inmunoensayos (Branson, 2007. Clin. Infect. Dis., 45: S221-S225).

La posibilidad de disponer de plataformas portátiles que permitan una detección rápida es particularmente necesaria en zonas geográficas carentes de instalaciones médicas adecuadas. En este contexto, los biosensores parecen ser una alternativa prometedora a los métodos convencionales de análisis (Amano and Cheng, 2005. Anal. Bioanal. Chem., 381: 156-164; Bobby Pejcic et al., 2006. Analyst, 131: 1079-1090). Las enzimas alostéricas pueden ser utilizadas como biocomponentes eficaces dado que su actividad se ve modulada por el reconocimiento específico de péptidos diana, fuera del sito activo, por anticuerpos específicos contra dichos péptidos (Villaverde, 2003. FEBS Lett., 554: 169-172). Los sensores alostéricos se pueden construir mediante ingeniería de inserción proteínica a partir de la selección apropiada de sitios permisivos en la enzima y de un péptido antígeno del patógeno. La reacción alostérica se puede seguir en ensayos enzimáticos y después de tiempos cortos de reacción en ensayos homogéneos sencillos. Esto ofrece posibilidades interesantes para el diagnóstico molecular rápido y ultra-rápido de enfermedades infecciosas.

Entre las diferentes enzimas adaptadas para ser utilizadas como sensores alostéricos (Villaverde, 2003. FEBS Lett., 554: 169-172), la β-galactosidasa producida por Escherichia coli (β-D-galactoside hydrolase, E.C. 3.2.1.23) es muy conveniente. Esta proteína esta codificada en el gen lacZ y se compone de cuatro sub-unidades de 116353 Da cada una, unidas entre sí mediante unión no-covalente (Jacobson et al., 1994. Nature, 369: 761-766). Tiene la facultad de hidrolizar tanto la lactosa como algunos análogos sintéticos.

Recientemente se han descrito métodos que usan la β-galactosidasa de Escherichia coli, NF795gpC, inmovilizada en agarosa activada, para la detección de anticuerpos anti-VIH mediante la medición de la intensidad de color que aparece como consecuencia de la transformación del sustrato ONPG por acción de la enzima alostérica (Ferraza et al., 2007. Enzyme and Microbial Technology, 41(4): 492-497).

En la presente invención se usa para-aminofenil β-D-galactopiranosido (PAPG), un substrato que da lugar a la formación de p-aminofenol, un producto electro-activo, con la finalidad de desarrollar una nueva plataforma sensora basada en redes de microelectrodos. Una ventaja técnica importante de la presente invención respecto del método descrito por Ferraza et al. (2007) es que la combinación de las enzimas descritas y las redes de microelectrodos, dotan al nuevo biosensor de una mayor sensibilidad, con lo que se incrementa la eficacia en la detección de personas infectadas con el virus VIH.

En este sentido, en la presente invención, se presenta una solución al problema de la detección del virus VIH en personas infectadas que mejora el diagnóstico de esta enfermedad infecciosa en rapidez y especificidad al tiempo que provee un sistema de detección portátil y que no requiere detectores de alto coste ni personal especializado, como es el caso de los sistemas actuales citados anteriormente.

Explicación de la invención

En la presente invención se provee un sistema biosensor para la detección de anticuerpos anti-VIH en una muestra biológica, basado en la utilización combinada de una enzima alostérica (β-galactosidasa), modificada genéticamente y una matriz con redes de microelectrodos. Las enzimas alostéricas presentan una actividad específica diferente según su conformación estérica. Dicha conformación se modifica al unirse la enzima a un efector alostérico específico. Cuando los anticuerpos anti-VIH se unen a la enzima por medio de péptidos, que constituyen la modificación de la enzima alostérica original, la conformación 3D cambia positivamente afectando al rendimiento del sitio activo, estimulando la actividad enzimática. Un punto clave del biosensor que se presenta en esta invención, es la utilización de un sustrato de la enzima alostérica cuyo producto sea electroactivo, por ejemplo, una molécula que pueda ser oxidada sobre diversos materiales de los microelectrodos dentro de un rango de pH conveniente para la enzima alostérica. Otra de las ventajas de este biosensor es su alta sensibilidad, pudiéndose detectar concentraciones traza de producto.

La concentración de producto es una medida indirecta de la cantidad de anticuerpos anti-VIH, presentes en la muestra biológica, que se unen a los péptidos anclados en la enzima alostérica original ya que, como se ha comentado previamente, la unión de los anticuerpos anti-VIH (ejercen de efectores alostéricos), favorece la actividad enzimática.

Así pues, la presente invención combina dos grandes avances tecnológicos que permiten la detección de la infección por VIH en muestras de suero sanguíneo. Se ha utilizado una β-galactosidasa alostérica genéticamente modificada que responde a la presencia de anticuerpos anti-VIH. Además se han utilizado microtecnologías para fabricar redes de microelectrodos como transductor de la señal electroquímica, generada por el producto de la reacción enzimática, que es detectada por sistemas sencillos descritos más adelante.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención se describe un biosensor que comprende:

1. Biosensor que comprende: