Un biosensor para usar en la determinación de la concentración de un analito en una muestra fisiológica,

comprendiendo dicho dispositivo: una cámara de llenado adaptada para llenarse por vía de acción capilar; una cámara de reacción que incluye un sitio de unión inmovilizado y una sonda conjugada, en la que la sonda conjugada comprende una pareja de unión adaptada para unirse al sitio de unión inmovilizado, en la que el sitio de unión inmovilizado está colocado sobre al menos una perla magnética, y en la que el sitio de unión inmovilizado y la sonda conjugada están colocados sobre diferentes superficies dentro de la cámara de reacción; una cámara de detección que incluye electrodos para detectar una reacción electroquímica en la cámara de detección; y un paso para fluido entre la cámara de reacción y la cámara de detección, en el que la presencia o ausencia de un analito diana en la muestra de fluido tiene como resultado un cambio en la cantidad de sonda conjugada unida en la cámara de reacción, siendo el cambio detectable con una reacción electroquímica en la cámara de detección

Antecedentes de la invención

Sensores biomédicos convencionales, incluidos sistemas basados en inmunoensayos, se han usado para comunicar la presencia y/o concentración de una amplia variedad de analitos. En general, los inmunoensayos se clasifican en dos categorías: ensayos de competición y ensayos de tipo sándwich. En un ensayo de competición, el antígeno en la muestra de ensayo se mezcla con un complejo antígeno-sonda (normalmente denominado complejo indicador) y, después, la mezcla compite por unirse al anticuerpo. La sonda puede ser un radioisótopo, un fluoróforo o un cromóforo. En un inmunoensayo de tipo sándwich, el antígeno en la muestra de ensayo se une al anticuerpo y, después, un segundo complejo anticuerpo-sonda se une al antígeno. En estos procedimientos de ensayo de la técnica anterior, normalmente se requiere una o más etapas de lavado. Las etapas de lavado introducen complejidad en el procedimiento de ensayo y pueden generar residuos líquidos biopeligrosos.

Normalmente, los inmunoensayos proporcionan al usuario un resultado cualitativo (p. ej., una “respuesta sí/no”) obtenido, con mayor frecuencia, mediante una simple detección visual (p. ej., un cambio de color) o un resultado 15 cuantitativo, tal como una concentración de un antígeno. La mayoría de los procedimientos cuantitativos implican caras piezas de equipo, tal como contadores de centelleo (para monitorizar la radioactividad), espectrofotómetros, espectrofluorímetros (p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.156.972), instrumentos para resonancia en plasmón superficial (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.965.456) y similares. Por tanto, sería ventajosos desarrollar in inmunoensayo que sea barato y lo suficientemente simple de usar como para que sea adecuado para usar en domicilio o en campo. Preferentemente, tal biosensor no requeriría etapas de centrifugación, dilución, pipeteo, lavado o de tiempo, y generaría una cantidad mínima de residuos.

Cada uno de los documentos WO-A-02/08763 y EP-A-1347302 describen dispositivos sensores que emplean reacciones anticuerpo-antígeno y comprenden una cámara de reacción y una cámara de detección.

Sumario de la invención

25 En el presente documento se divulgan dispositivos biosensores y procedimientos para detectar y/o cuantificar un analito de interés. La presente invención proporciona un biosensor para usar en la detección de un analito diana en una muestra de fluido como se ha definido en la reivindicación 1. Cuando una muestra se introduce en la cámara de reacción se produce una reacción de unión entre la diana de unión, la sonda-conjugado y/l el analito diana (si están presentes) inmovilizados. En una realización de ejemplo, si el analito diana está presente produce un cambio en la cantidad de sonda conjugada que está unida al sitio de unión inmovilizado. Este cambio se puede detectar en la cámara de detección.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricación de un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la detección de un analito diana en una muestra de fluido, comprendiendo las etapas de:

proporcionar una primera capa (136); eliminar una sección de la primera capa (136) para formar una parte de cámara de llenado (107), una parte de cámara de reacción (122) y una parte de cámara de detección (128);

proporcionar una segunda capa (134);

Montar un primer lado de la segunda capa (134) a un primer lado de la primera capa (136);

Eliminar una sección de la segunda capa (136) que se extiende sobre la parte de la cámara de llenado (107), en

40 registro sustancial con la parte de cámara de llenado (107), extendiéndose además la segunda capa (134) sobre la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128), en el que la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128) están en comunicación fluida con la parte de cámara de llenado (107);

proporcionar una tercera capa (132);

45 montar un primer lado de la tercera capa (132) en un segundo lado de la primera capa (136), extendiéndose la tercera capa (132) sobre la parte de cámara de llenado (107), la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128);

montar un primer lado de la capa de sellado (142) a un segundo lado de la segunda capa (134); 5

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45

de modo que las capas forman una tira que tiene una pluralidad de superficies exteriores;

formar un paso que se extiende a través de una superficie exterior de la tira hacia el interior de la cámara de detección de modo que forma una ventilación de la cámara de detección (130); y colocar un sitio de unión inmovilizado (44) y la sonda conjugada (50) dentro de la cámara de reacción (122).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricación de un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la detección de un analito diana en una muestra de fluido, comprendiendo las etapas de:

proporcionar una primera capa (36);

eliminar una sección de la primera capa (36) para formar una parte de cámara de llenado (107),

una parte de cámara de reacción (22) y una parte de cámara de detección (28);

proporcionar una segunda capa (34);

montar un primer lado de la segunda capa (34) sobre un primer lado de la primera capa (36), extendiéndose la segunda capa (34) sobre la parte de cámara de llenado (107), la parte de cámara de reacción (22) y la parte de cámara de detección (22);

proporcionar una tercera capa (32);

montar un primer lado de la tercera capa (32) en un segundo lado de la primera capa (36), extendiéndose la tercera capa (32) sobre la parte de cámara de llenado (107), la

parte de cámara de reacción (22) y la parte de cámara de detección (28);

montar un primer lado de una primera capa de sellado (42) sobre un segundo lado de la segunda capa (34);

montar un primer lado de una segunda capa de sellado (46) sobre un segundo lado de la tercera capa (32); de modo que las capas forman una tira que tiene una pluralidad de superficies exteriores;

formar un paso que se extiende a través de una superficie exterior de la tira hacia el interior de la cámara de detección de modo que forma una ventilación de la cámara de detección (30); y colocar un sitio de unión inmovilizado (44) y la sonda conjugada (50) dentro de la cámara de reacción,

en el que la altura de la cámara de reacción (22) es mayor que la de la cámara de detección (28), o la cámara de reacción (22) y la cámara de detección (28) tienen igual altura y las superficies de la cámara de reacción (22) y/o la cámara de detección (28) están modificadas, o se añaden materiales de llenado a la cámara de detección (28).

En una realización, el sitio de unión inmovilizado incluye un anticuerpo adaptado para unirse a un antígeno diana y la sonda conjugada incluye un anticuerpo adaptado para unirse a un antígeno diana unido. Si hay un antígeno diana en una muestra de fluido, el sitio de unión inmovilizado se puede unir a un sitio sobre el antígeno diana y la sonda conjugada se puede unir a otro sitio sobre el antígeno diana. Por tanto, la presencia de un antígeno diana en la muestra de fluido tiene como resultado un incremento de la cantidad de sonda unida en la cámara de reacción y una reducción en la cantidad de sonda conjugada en la cámara de detección.

La diana de unión inmovilizada, la sonda conjugada y el analito diana pueden incluir los diversos ligandos conocidos. Por ejemplo, un experto en la técnica apreciará que la diana de unión inmovilizada, la sonda conjugada y el analito diana pueden incluir un antígeno o anticuerpo, una hormona o neurotransmisor y un receptor, un sustrato o efectos alostérico y una enzima, lectinas y azúcares, estructuras de ADN o ARN, tales como aptámeros y sus especies de unión (incluidas otras especies de ADN o ARN o proteína de unión) proteínas, biotina y sistemas de adivina o estreptavidina, enzimas y sus sustratos e inhibidores, sistemas de unión a lípidos, y combinaciones de los mismos. Para facilitar la comprensión de los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento, en adelante se describirán ligandos inmunológicos y se hará referencia al dispositivo como... [Seguir leyendo]

1. Un biosensor para usar en la determinación de la concentración de un analito en una muestra fisiológica, comprendiendo dicho dispositivo:

una cámara de llenado adaptada para llenarse por vía de acción capilar;

una cámara de reacción que incluye un sitio de unión inmovilizado y una sonda conjugada, en la que la sonda conjugada comprende una pareja de unión adaptada para unirse al sitio de unión inmovilizado, en la que el sitio de unión inmovilizado está colocado sobre al menos una perla magnética, y en la que el sitio de unión inmovilizado y la sonda conjugada están colocados sobre diferentes superficies dentro de la cámara de reacción;

una cámara de detección que incluye electrodos para detectar una reacción electroquímica en la cámara de detección; y un paso para fluido entre la cámara de reacción y la cámara de detección, en el que la presencia o ausencia de un analito diana en la muestra de fluido tiene como resultado un cambio en la cantidad de sonda conjugada unida en la cámara de reacción, siendo el cambio detectable con una reacción electroquímica en la cámara de detección.

2. El biosensor de la reivindicación 1, en el que el sitio de unión inmovilizado es un antígeno y la pareja de unión es un anticuerpo.

3. El biosensor de la reivindicación 1, en el que el sitio de unión inmovilizado es un anticuerpo y la pareja de unión es un antígeno.

4. El biosensor de la reivindicación 1, en el que la dimensión capilar de la cámara de reacción es menor en cuanto a tamaño que la de la cámara de llenado.

5. El biosensor de la reivindicación 1, en el que la cámara de detección incluye un orificio de ventilación.

6. El biosensor de la reivindicación 5, en el que el orificio de ventilación puede abrirse perforando una capa exterior del dispositivo.

7. El biosensor de la reivindicación 5, en el que el orificio de ventilación puede abrirse eliminando una porción de la capa exterior del dispositivo.

8. El biosensor de la reivindicación 5, en el que el orificio de ventilación puede abrirse desgarrando a lo largo de una perforación.

9. El biosensor de la reivindicación 1, en el que la cámara de reacción incluye una abertura hacia la atmósfera.

10. El biosensor de la reivindicación 1, en el que al menos una perla magnética es secada sobre una superficie interna de la cámara de reacción.

11. El biosensor de la reivindicación 1, que además comprende un imán.

12. El biosensor de la reivindicación 11, en el que el imán está dispuesto de modo que mueva la al menos una perla magnética para que entre en contacto íntimo con la sonda conjugada después de que la muestra de fluido se haya introducir en la cámara de reacción.

13. El biosensor de la reivindicación 1, en el que la sonda conjugada incluye una enzima.

14. El biosensor de la reivindicación 13, que además comprende un mediador y un sustrato enzimático.

15. Un procedimiento para detectar un analito diana en una muestra de fluido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

suministrar una muestra a un biosensor definido en la reivindicación 1;

permitir progresar una reacción en la cámara e reacción entre un sitio de unión inmovilizado y una sonda conjugada; y

mover la muestra dentro una cámara de detección y detectar electroquímicamente el nivel de la sonda conjugada, en el que la presencia de un analito diana en la muestra tiene como resultado un incremento o una disminución en la cantidad de sonda conjugada detectada en la cámara de detección.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el sitio de unión inmovilizado incluye un antígeno diana y la sonda conjugada incluye un anticuerpo adaptado para unirse al antígeno diana.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la sonda conjugada incluye una enzima.

18. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la muestra se desplaza desde la cámara de reacción a la cámara de detección por acción capilar.

19. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la etapa de mover la muestra incluye abrir un orificio de ventilación.

20. El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende la etapa de cuantificar la cantidad de antígeno diana en la muestra en base a las señales eléctricas recibidas desde la cámara de detección.

21. Un procedimiento de fabricación de un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la detección de un analito diana en una muestra de fluido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar una primera capa (136);

eliminar una sección de la primera capa (136) para formar una parte de cámara de llenado (107), una parte de cámara de reacción (122) y una parte de cámara de detección (128);

proporcionar una segunda capa (134);

montar un primer lado de la segunda capa (134) a un primer lado de la primera capa (136);

eliminar una sección de la segunda capa (136) que se extiende sobre la parte de la cámara de llenado (107), en registro sustancial con la parte de cámara de llenado (107), extendiéndose además la segunda capa (134) sobre la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128), en el que la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128) están en comunicación fluida con la parte de cámara de llenado (107);

proporcionar una tercera capa (132);

montar un primer lado de la tercera capa (132) en un segundo lado de la primera capa (136), extendiéndose la tercera capa (132) sobre la parte de cámara de llenado (107), la parte de cámara de reacción (122) y la parte de cámara de detección (128);

montar un primer lado de una capa de sellado (142) sobre un segundo lado de la segunda capa (134); de modo que las capas forman una tira que tiene una pluralidad de superficies exteriores;

formar un paso que se extienda a través de una superficie exterior de la tira hacia el interior de la cámara de detección de modo que forme una ventilación de la cámara de detección (130); y

Situar un sitio de unión inmovilizado (44) y sonda conjugada (50) dentro de la cámara de reacción (122).

22. Un procedimiento de fabricación de un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la detección de un analito diana en una muestra de fluido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

proporcionar una primera capa (36); eliminar una sección de la primera capa (36) para formar una parte de cámara de llenado (107), una parte de cámara de reacción (22) y una parte de cámara de detección (28);

proporcionar una segunda capa (34); montar un primer lado de la segunda capa (34) en un primer lado de la primera capa (36), extendiéndose la

segunda capa (34) sobre la parte de cámara de llenado (107), la parte de cámara de reacción (22) y la parte de cámara de detección (22); proporcionar una tercera capa (32); montar un primer lado de la tercera capa (32) en un segundo lado de la primera capa (36), extendiéndose la

tercera capa (32) sobre la parte de cámara de llenado (107), la parte de cámara de reacción (22) y la parte de cámara de detección (28);

montar un primer lado de una primera capa de sellado (42) en un segundo lado de la segunda capa (34); montar un primer lado de una segunda capa de sellado (46) en un segundo lado de la tercera capa (32); de modo que las capas forman una tira que tiene una pluralidad de superficies exteriores;

formar un paso que se extienda a través de una superficie exterior de la tira hacia el interior de la cámara de detección de modo que forme una ventilación de la cámara de detección (30); y

colocar un sitio de unión inmovilizado (44) y una sonda conjugada (50) dentro de la cámara de reacción, en el que bien la altura de la cámara de reacción (22) es mayor que la de la cámara de detección (28), o la cámara de reacción (22) y la cámara de detección (28) tienen igual altura y las superficies de la cámara de reacción (22) y/o la cámara de detección (28) están modificadas, o se añaden materiales de llenado a la cámara de detección (28).