Aislamiento de células hipofisarias multipotentes y diferenciación in vitro de las mismas.

El procedimiento de la invención se basa en la presencia en las células hipofisarias multipotentes de un receptor de la cara exterior de la membrana, GFRa2+, que no presentan otras células de la hipófisis. El procedimiento de aislamiento utiliza anticuerpos dirigidos contra ese receptor y técnicas que permiten la separación de las células a las que se hayan unido dichos anticuerpos. Una vez aisladas, las células pueden mantenerse en cultivo sin diferenciarse o puede provocarse su diferenciación, para dar lugar a células productoras de hormonas hipofisarias o a células con fenotipo de neuronas. Así, las células aisladas por el procedimiento de la invención pueden utilizarse para la producción de hormonas hipofisarias. El uso de anticuerpos dirigidos contra GFRa2+, acoplados a moléculas señalizadoras, permite también la identificación de la presencia de las células hipofisarias multipotentes en cualquier muestra

Aislamiento de células hipofisarias multipotentes y diferenciación in vitro de las mismas.

Campo técnico

La invención se refiere a un método para el aislamiento de células multipotentes no hormonales de la hipófisis, a las células aisladas mediante dicho método, a su uso para el estudio de trastornos hipofisarios tales como el hipopituitarismo, a su uso para la obtención de hormonas mediante la diferenciación previa de dichas células y a la identificación de la presencia o ausencia de las células multipotentes en una muestra de hipófisis gracias a la identificación de la presencia de un marcador característico en su membrana.

Antecedentes de la invención

La hipófisis (mencionada también en algunos textos como glándula pituitaria) es un órgano endocrino central, situado debajo del hipotálamo, que regula funciones fisiológicas básicas tales como el crecimiento, la respuesta al estrés, la reproducción, la lactancia y la homeostasis metabólica. Consta de tres lóbulos: la adenohipófisis, donde las células secretoras forman agregados llamados acinares; el lóbulo intermedio, donde se concentran los melanotropos (sintetizan péptidos derivados del gen de de POMC: proopiomelanocortina), y la neurohipófisis, donde los terminales de los axones hipotalámicos liberan ADH (hormona antidiurética, conocida también como vasopresina) y oxitocina. Entre el lóbulo intermedio y la adenohipófisis se halla una hendidura alrededor de la cual se sitúa la llamada zona marginal. La capa de células opuesta a la hendidura se origina, como la adenohipófisis, en la bolsa de Rathke formada a partir del ectodermo oral durante el desarrollo embrionario.

La adenohipófisis alberga varios tipos de células endocrinas secretoras de hormonas que regulan la función de otros órganos y glándulas endocrinas a lo largo de la vida. Así, los somatotropos, lactotropos y tirotropos, que son células que expresan Pit-1, segregan la hormona del crecimiento (GH), la prolactina (PRL), y la hormona estimulante de la tiroides (TSH), respectivamente; los corticotropos segregan la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y los gonadotropos segregan la hormona luteinizante (LH) y/o la hormona estimulante del folículo (FSH). Todas estas células de la adenohipófisis surgen durante el desarrollo de un primordio ectodérmico común conocido como la bolsa de Rathke. Sin embargo, no se sabe mucho sobre la renovación de las células de la hipófisis a lo largo de la vida y su regulación homeostásica durante cambios fisiológicos específicos tales como la pubertad o el embarazo o en condiciones patológicas tales como el desarrollo tumoral. Para explicar estos cambios, se han propuesto tanto la proliferación celular de las células secretoras individuales diferenciadas como la proliferación asimétrica, seguida de diferenciación terminal, de células madre/progenitoras, presentes en la hipófisis, que mantienen la homeostasis de esta glándula y generan las células endocrinas (productoras de hormonas) (Vankelecom H, 2007b; Melmed S, 2003).

Tal como ha sido revisado por Fuchs y colaboradores (Fuchs E et al., 2004), las células madre adultas son células que se dividen infrecuentemente y residen en microambientes protegidos o nichos (revisado por Moore K A y Lemischka I R, 2006), con una tasa baja de erosión telomérica a lo largo de su tiempo de vida. Las células madre, además, residen frecuentemente en un microambiente tridimensional con expresión incrementada de la ruta Wnt/b-catenina. Existen también ciertos genes que son considerados como marcadores de células madre, entre los que se pueden citar los siguientes:

- Oct4, que es bien conocido por su expresión en la masa de células internas de la blástula, aunque su hipotético papel en la renovación de las células madre adultas pluripotenciales (Lengner C J et al, 2007) debe ser mejor definido;

- Los genes Sox, que tienen papeles relevantes en las células madre embrionarias y adultas con una función significativa en los tejidos derivados del neuroectodermo (Pevny L H et al., 1997). Las mutaciones del gen Sox9 son responsables de una enfermedad autosómica dominante muy grave llamada Displasia Campomélica, en la que los niños presentan en el momento del nacimiento muchos defectos esqueléticos y extraesqueléticos que incluyen la reversión del sexo y mueren muy jóvenes (Wunderle V M et al., 1998). Las mutaciones en el gen Sox2 causan hipoplasia hipofisaria asociada con hipogonadismo hipogonadotrópico y anormalidades encefálicas, oculares y óticas (Hagstrom S A et al, 2005; Kelberman D et al., 2006).

La existencia de una célula primordial en la hipófisis se propuso hace más de diez años, cuando en casos excepcionales adenomas hipofisarios humanos expresaron simultáneamente hormonas dependientes de Pit-1 (GH, PRL y TSH) más ACTH y hormonas gonadotrópicas, pero la identidad de esas supuestas células madre/progenitoras hipofisarias no está bien establecida.. De hecho, tal como ha sido revisado por Vankelecom (Vankelecom H, 2007a) se han descrito en la hipófisis diversas células no hormonales, cuya función no se comprende bien, y que se han propuesto como candidatas a células madre/progenitoras hipofisarias, células entre las cuales se incluyen células de la zona marginal que bordean la hendidura hipofisaria, originadas en la bolsa de Rathke, y las células foliculoestrelladas (FS) que se localizan por todo el parénquima hipofisario. En general, las evidencias presentadas en apoyo de esta función para los distintos tipos de células mencionadas pueden considerarse poco concluyentes y, además, los grupos descritos de células candidatas a células madre/progenitoras constituyen grupos de células heterogéneos, en los que no es segura la función de cada uno de los tipos de células que los integran.

Recientemente, ensayos realizados con células adenohipofisarias extraídas de ratones han permitido observar que una población colateral (células SD) que excluye de forma eficaz el colorante vital Hoechst 33342 (uno de los métodos utilizados para la posible identificación de células madre adultas en diversos tejidos), se segrega parcialmente con un grupo de células de la hipófisis que son capaces de formar esferas clonales flotantes en cultivo (Chen J et al., 2005) (otro de los métodos habitualmente utilizados para aislar y caracterizar potenciales células madre/progenitoras de numerosos tejidos) y que expresan genes comúnmente reconocidos como marcadores de células madre, tales como Sca1 y, adicionalmente, en la mayor parte de ellas, Oct4, Nanog, nestina, prominina-1 y Bmi-1, así como también moléculas de señalización que han sido implicadas en la renovación de células madre y en la determinación del destino final de esas células en diversos tejidos (componentes de las rutas de señalización de Notch, Wnt o Shh, tales como Notch-1, Hes1, los receptores Fzd o el receptor de Shh Patched1). Estas células, sin embargo, eran negativas para el marcador Prop1, un factor de transcripción conocido por su expresión exclusiva durante el desarrollo de la hipófisis, cuya deficiencia es responsable del enanismo de Ames en ratones (Nasokin I O et al, 2004), y del hipopituitarismo con Deficiencia Combinada de Hormonas Hipofisarias (CPHD) en seres humanos (Wu W et al, 1998), una alteración esta última en la que la hipófisis experimenta una pérdida progresiva general de células secretoras de hormonas, que parece estar asociada a una pérdida de células progenitoras. Entre las células SD que eran positivas para el marcador Sca1, una pequeña proporción mostraba características fenotípicas de las células foliculoestrelladas (FS), tales como la capacidad de incorporación del dipéptido β-Ala-Lys-Nvarepsilon-AMCA o la presencia de la proteína S100, lo que es indicativo de que la población analizada contiene una mezcla variada de diferentes tipos celulares y marcadores.. Sin embargo, a parte del profuso estudio descrito sobre expresión de marcadores y capacidad de generación de esferas, en el artículo no se aporta ninguna prueba de que alguna de estas células, o las esferas generadas a partir de ellas, sean capaces de diferenciarse dando lugar a diferentes linajes celulares adenohipofisarios.

Otros autores (Lepore D A et al., 2005) han aislado células formadoras de colonias de la hipófisis (PCFCs), que son capaces de generar colonias a partir de cultivos primarios de células de hipófisis de ratón, mostrando un notable potencial clonogénico. La mayoría de las células PCFC detectadas por esos autores exhiben características morfológicas y antigénicas coincidentes...

1. Un método para el aislamiento de células hipofisarias multipotentes, que comprende las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la dispersión de las células presentes en la muestra de hipófisis de partida se lleva a cabo digiriendo dicha muestra con colagenasa.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo anti-GFRa2 se acopla a una sustancia o partícula que facilita la separación de las células a las que se haya unido dicho anticuerpo, bien porque la sustancia o partícula esté directamente unido al anticuerpo anti-GFRa2, o bien porque la sustancia o partícula esté unida a un anticuerpo secundario que reconozca el anticuerpo anti-GFRa2.

4. Método según la reivindicación 3, en el que la sustancia o partícula a la que se acopla el anticuerpo anti-GFRa2 se selecciona entre un compuesto fluorescente y una partícula magnética.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la sustancia a la que se acopla el anticuerpo anti-GFRa2 es un compuesto fluorescente.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la separación de las células a las que se ha unido el anticuerpo anti-GFRa2 se produce mediante separación de células activadas por fluorescencia (FACS).

7. Método según la reivindicación 4, en el que la sustancia a la que se acopla el anticuerpo anti-GFRa2 es una partícula magnética.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la separación de las células a las que se ha unido el anticuerpo anti-GFRa2 se produce por medios magnéticos.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la separación de las células a las que se ha unido el anticuerpo anti-GFRa2 se produce mediante la aplicación de la metodología de separación de células activadas por medios magnéticos (MACS).

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que la muestra que ha sido puesta en contacto con el anticuerpo anti-GFRa2 se pone en contacto, previamente a la etapa de separación de las células, con un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo anti-GFRa2 y que lleva una unida una sustancia o partícula que facilita la separación de las células.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de células de hipófisis dispersas se ha obtenido a partir de una muestra de tejido de hipófisis de un mamífero seleccionado entre ratón, rata y ser humano.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el mamífero es un mamífero adulto.

13. Una célula multipotente no hormonal aislada, procedente de hipófisis post-embrionaria, caracterizada por ser positiva para el receptor GFRa2.

14. Célula aislada según la reivindicación 13, que es positiva para los marcadores Oct4, Sox2 y Sox9.

15. Célula aislada según la reivindicación 13 ó 14, que es positiva para los marcadores b-catenina y E-cadherina.

16. Célula aislada según la reivindicación 15, que es positiva para los marcadores SSEA y Prop1.

17. Célula aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que es negativa para los marcadores Sox4, Nanog y nestina.

18. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que procede la hipófisis de un mamífero seleccionado entre ratón, rata o ser humano.

19. Célula según la reivindicación 18, que procede de la hipófisis de un mamífero adulto.

20. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que se ha aislado mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

21. Un método de identificación de células multipotentes hipofisarias en una muestra extraída de la hipófisis de un mamífero que comprende poner en contacto dicha muestra de hipófisis con una composición que comprende un anticuerpo primario que reconoce el receptor GFRa2 (anticuerpo anti-GFRa2), anticuerpo que se acopla a una sustancia que permite su detección.

22. Método de identificación de células según la reivindicación 21, en el que la muestra se pone opcionalmente en contacto con un segundo anticuerpo primario que reconoce un marcador seleccionado entre b-catenina, E-cadherina, Sox2, Sox9, Oct4 y Prop1, segundo anticuerpo que se acopla a una sustancia que permite su detección y que es diferente de la sustancia que se acopla al anticuerpo anti-GFRa2.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que la sustancia que permite la detección del anticuerpo que reconoce un marcador está unida directamente al anticuerpo.

24. Método según la reivindicación 21 ó 22, en el que la sustancia que permite la detección del anticuerpo que reconoce un marcador está a un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario.

25. Método según la reivindicación 24, en el que la muestra puesta en contacto con el anticuerpo anti-GFRa2 y, opcionalmente, con un anticuerpo que reconoce un marcador seleccionado entre b-catenina, E-cadherina, Sox2, Sox9 y Oct4, se pone en contacto con al menos un anticuerpo secundario que reconozca ese anticuerpo primario por cada uno de los anticuerpos primarios que reconozcan GFRa2, b-catenina, E-cadherina, Sox2, Sox9 u Oct4 que se hayan puesto en contacto con la muestra extraída de la hipófisis, estando cada anticuerpo secundario unido a una sustancia que permita su detección y siendo diferentes entre sí cada una de las sustancias unidas a un anticuerpo secundario diferente.

26. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 21a 25, en el que la sustancia que permite la detección del anticuerpo se selecciona entre un fluoróforo y una enzima que cataliza la conversión de un compuesto en un compuesto coloreado.

27. Método según la reivindicación 26, en el que la sustancia que permite la detección del anticuerpo es un fluoróforo se selecciona entre Cy3, Cy5, Alexa Fluor 488 o FITC.

28. Método según la reivindicación 28, en el que la sustancia que permite la detección del anticuerpo es una enzima que se selecciona entre fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano.

29. Método para la expansión in vitro de una célula aislada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de una célula aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que comprende cultivar dichas células de manera que cumpla al menos una de las siguientes condiciones:

30. Método según la reivindicación 29, en el que la expansión se produce en un medio libre de suero es medio DMEM/F12 1:1 que comprende un suplemento diseñado para permitir el crecimiento de células nerviosas diferenciadas o células progenitoras de células nerviosas en ausencia de suero y de células de soporte inactivadas y/o con un suplemento diseñado para permitir el crecimiento de neuronas embrionarias o células embrionarias progenitoras de neuronas de sistema nerviosos central.

31. Método según la reivindicación 30, en el que el medio libre de suero es medio DMEM/F12 1:1 que comprende:

- Suplemento B27 1x

- Suplemento N2 1x

- al menos un antibiótico.

32. Método según la reivindicación 29, en el que la expansión se produce en un recipiente de cultivo recubierto de gelatina, en un medio de cultivo que contiene medio aspirado de un cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mantenidos durante 6 días en DMEM que contenía suero bovino fetal al 20%, aminoácidos no esenciales al 1%, glutamina 2 mM, β-mercaptoetanol 0,1 mM y al menos un antibiótico.

33. Método según la reivindicación 32, en el que el medio de cultivo es una mezcla 1:1 (vol/vol) de medio StemM y medio acondicionado en MEF, cada uno de los cuales consiste en lo siguiente:

- aminoácidos no esenciales al 1%,

- glutamina 2 mM,

- β-mercaptoetanol 0,1 mM

- medio de sustitución de suero Knockout^TM (KO) al 20%,

- medio KO-DMEM al 80%, suplementado con al menos un antibiótico;

medio aspirado y filtrado de un cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mantenidos durante 6 días en DMEM que contenía suero bovino fetal al 20%), aminoácidos no esenciales al 1%, glutamina 2 mM, β-mercaptoetanol 0,1 mM y al menos un antibiótico.

34. Método según la reivindicación 33, en el que el medio de cultivo contiene adicionalmente ESGRO®.

35. Método según la reivindicación 29, en el que la expansión de las células se produce sobre células de soporte inactivadas para que no proliferen.

36. Método según la reivindicación 35, en el que las células de soporte inactivadas son fibroblastos embrionarios inactivados con mitomicina.

37. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, que comprende una etapa de diferenciación de las células en cultivo.

38. Método según la reivindicación 37, en el que las células en cultivo se siembran sobre una matriz polimérica y se cultivan en un medio que contiene suero.

39. Método según la reivindicación 38, en el que las células en cultivo se siembran sobre colágeno tipo IV.

40. Método según la reivindicación 39, en el que las células en cultivo se mantienen al menos durante al menos un día en el medio que contiene suero.

41. Método según la reivindicación 39 ó 40, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación que es una mezcla 1:1 (vol/vol) de medio SSM y medio acondicionado en la línea celular de hipófisis de rata GH4C1, suplementado con al menos un antibiótico, donde:

42. Método según la reivindicación 39 ó 40, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación que es una mezcla 1:1 (vol/vol) de una mezcla DMEM/F12 de Ham 1:1 (vol/vol) y medio acondicionado en la línea celular de hipófisis de rata GH4C1, suplementado con al menos un antibiótico.

43. Método según la reivindicación 39 ó 40, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación compuesto por SSM, suero bovino fetal (FBS) al 1% y suplemento N2 1x, suplementado con al menos un antibiótico.

44. Método según la reivindicación 39 ó 40, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación que contiene suplemento B27 1x, FGF 0,5 ng/ml, GHRH 10-9 M, Ghrelina 10-9 M, somatostatina 10-9 M, hidrocortisona 10-9 M, 5 μg/ml transferrina, 10 μg/ml de insulina en DMEM/F12 de Ham 1:1 (vol/vol), suplementado con al menos un antibiótico.

45. Método según la reivindicación 39 ó 40, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación que es una mezcla 1:1 de medio SSM y medio acondicionado en la línea celular de hipófisis de rata GH3, suplementado con al menos un antibiótico, donde:

46. Método según la reivindicación 38, en el que las células en cultivo se siembran sobre poli-L-lisina.

47. Método según la reivindicación 46, en el que las células en cultivo se mantienen al menos un día en el medio que contiene suero.

48. Método según la reivindicación 46 ó 47, en el que el medio que contiene suero se sustituye por un medio de diferenciación que contiene suplemento B27 1x, FGF 0,5 ng/ml, GHRH 10-9 M, Ghrelina 10-9 M, somatostatina 10-9 M, hidrocortisona 10-9 M, 5 μg/ml transferrina, 10 μg/ml de insulina en DMEM/F12 de Ham 1:1 (vol/vol), suplementado con al menos un antibiótico.

49. Método según la reivindicación 38, en el que el cultivo de las células previo a su diferenciación se produce por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31.

50. Método según la reivindicación 49, en el que las células se mantienen en cultivo durante al menos 3 días previamente a su diferenciación, hasta obtener esferoides.

51. Método según la reivindicación 48, en el que las células se mantienen en cultivo durante al menos 5 a 7 días previamente a su diferenciación, hasta obtener esferoides.

52. Método según la reivindicación 50 ó 51, en el que las células en cultivo que se siembran sobre una matriz polimérica para su diferenciación están en forma de esferoides.

53. Método según la reivindicación 52, en el que los esferoides sembrados sobre la matriz polimérica se mantienen durante al menos un día en una mezcla 1:1 (vol/vol) de DMEM y F12 que comprende adicionalmente Suplemento B27 1x, Suplemento N2 1x y FCS al 10%, suplementado con al menos un antibiótico.

54. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 41, en el que el antibiótico con el que se suplementan los medios de cultivo se selecciona entre penicilina, estreptomicina, anfotericina B o mezclas de los mismos.

55. Método según la reivindicación 54, en el que el antibiótico es una mezcla de penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml).

56. Método según la reivindicación 54, en el que el antibiótico es una mezcla de penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y anfotericina B (2,5 μg/ml).

57. Una población de células aisladas derivadas de la hipófisis que comprende células seleccionadas del grupo de las células aisladas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, células aisladas de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 y células obtenidas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 56, o combinaciones de las mismas.

58. Uso de una célula aislada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de una célula aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, de una célula obtenida por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 56, o de una población de células de la reivindicación 57, para la producción de al menos una hormona que se selecciona entre hormona del crecimiento (GH), prolactina (PRL), hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante del folículo (FSH).

59. Uso según la reivindicación 58, en el que las células se utilizan para la producción de hormona del crecimiento (GH) y las células se diferencian por el método de la reivindicación 42.

60. Uso según la reivindicación 58, en el que las células se utilizan para la producción de prolactina (PRL) y las células se diferencian por el método de la reivindicación 43.

61. Uso según la reivindicación 58, en el que las células se utilizan para la producción de hormona estimulante de la tiroides (TSH) y las células se diferencian por el método de la reivindicación 44 o por el método de la reivindicación 48.

62. Uso según la reivindicación 58, en el que las células se utilizan para la producción de hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y las células se diferencian por el método de la reivindicación 41.

63. Uso según la reivindicación 58, en el que las células se utilizan para la producción de hormona estimulante del folículo (FSH) y las células se diferencian por el método de la reivindicación 45.

64. Uso de una célula seleccionada del grupo de las células aisladas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, las células aisladas de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 y las células obtenidas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 56, o de una población de células de la reivindicación 57, para el estudio de un trastorno de la hipófisis seleccionado entre el hipopituitarismo o el quiste de la hendidura de Rathke.

65. Uso de una célula seleccionada del grupo de las células aisladas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, las células aisladas de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 y las células obtenidas por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 56, o de una población de células de la reivindicación 57, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno de la hipófisis seleccionado entre el hipopituitarismo o el quiste de la hendidura de Rathke.