VESICULA CELULAR DENOMINADA "EXOSOMA", SU PREPARACION Y SU UTILIZACION EN LA ESTIMULACION DE UNA RESPUESTA INMUNITARIA.

Vesícula membranaria inmunógena, caracterizada porque está liberada de su entorno natural,

se deriva de una célula tumoral, comprende una bicapa lipídica que rodea una fracción citosólica, y presenta, en su superficie, unas moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad o CMH

Vesícula celular denominada "exosoma", su preparación y su utilización en la estimulación de una respuesta inmunitaria.

La presente invención tiene por objeto un nuevo procedimiento de sensibilización de células presentadoras de antígeno, nuevos medios para la realización del procedimiento, y nuevas vesículas membranarias que tienen poder inmunógeno.

Después de la demostración de la existencia de linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de antígenos tumorales presentados en el contexto de las moléculas de clase I (Rosenberg et al., 1996; Boon, 1992), varios laboratorios han podido demostrar que la inmunoterapia antitumoral es una estrategia terapéutica eficaz en los modelos animales (Pardoll, 1995). El principio de la inmunoterapia es inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra unos antígenos específicos de tumores. Actualmente, esto ha podido ser efectuado de diferentes formas. En principio, unas células tumorales que expresan unas moléculas de coestimulación recombinantes y/o unas citoquinas inmunomoduladoras son capaces de estimular unas respuestas antitumorales capaces de erradicar unos tumores sólidos in vivo (Zitvogel et al. 1996 [a]). Asimismo, unos péptidos derivados de antígenos tumorales (o antígenos exógenos expresados en las células tumorales) inyectados en diferentes formas químicas comprendida la utilización de liposomas o de virus (adenovirus o poxvirus por ejemplo) como vectores, son capaces de hacer remitir unos tumores. Finalmente, unas células presentadoras de antígenos profesionales, como las células dendríticas sensibilizadas con unos péptidos derivados de antígenos tumorales reinyectadas in vivo inducen unas respuestas antitumorales potentes, así como la regresión de tumores sólidos establecidos del ratón (Mayordomo et al., 1995).

Amigorena et al. (ver referencias p. 59) han descrito la acumulación, en el compartimento endocítico de los linfocitos B, de vesículas que expresan unas moléculas del CMH de clase II.

Zitvogel et al. (1998) dan a conocer los exosomas derivados de las células dendríticas.

La inmunoterapia basada en la utilización de las células dendríticas ha podido mostrar su eficacia en los estudios realizados en el ratón. Por ello, esta terapia ha sido recientemente transpuesta a clínica. En los Estados Unidos, unos ensayos están actualmente en curso con el fin de demostrar que unas células dendríticas cargadas de péptidos tumorales aumentan de manera significativa la frecuencia de células T citotóxicas específicas (CTL).

Una primera limitación de esta aproximación es la sensibilización de las células dendríticas con unos péptidos derivados de antígenos tumorales. En efecto, en la mayoría de los tumores, no han sido identificados antígenos específicos. Unos antígenos específicos del tumor son solamente conocidos en unos casos de tumores inducidos por virus (carcinoma del cuello uterino), en los casos de melanoma (antígenos de sí mismo, antígenos mutados, antígenos de diferenciación) o en un pequeño porcentaje de tumores de mama (oncógenos, o productos de genes supresores de tumor que han sufrido mutaciones). Sin embargo, la implicación directa de estos péptidos o antígenos tumorales en la eliminación de los tumores en el hombre queda por demostrar. Unos nuevos procedimientos de sensibilización de las células presentadoras de antígenos tales como las células dendríticas resultan por tanto necesarios. Estos procedimientos tienen por objetivo inducir unas respuestas antitumorales específicas en el contexto de moléculas de clase I y de clase II del CMH.

La mayor parte de los procedimientos de sensibilización de células dendríticas utilizados actualmente utilizan unos péptidos que corresponden a unos epítopos presentados en asociación con las moléculas de clase I e identificados en las células tumorales gracias a unos clones de CTL específicos del tumor. Sin embargo, estos procedimientos no son verosímilmente óptimos puesto que no tienen en cuenta los epítopos reconocidos en el contexto de las moléculas de clase II que son críticos para la proliferación de los linfocitos T auxiliares, necesarios para la obtención de las respuestas citotóxicas óptimas. Además, unos epítopos presentados por las células tumorales y los presentados por las células presentadoras de antígenos (como por ejemplo las células dendríticas), no son probablemente los mismos. Finalmente, unos péptidos tumorales reconocidos por los CTL están solamente disponibles para un pequeño porcentaje de pacientes que tienen unas moléculas de clase I de haplotipo apropiado.

El procedimiento de sensibilización ideal, de manera que pueda ser aplicado a cualquier tumor con un riesgo mínimo de inmunoselección, no debe estar restringido a un pequeño número de antígenos tumorales identificados. Asimismo, dicho procedimiento debería utilizar unos antígenos proteicos intactos más bien que unos péptidos, con el fin de permitir a la célula dendrítica prepararlos y presentar la combinación adecuada de péptidos en asociación con las moléculas de clase I y de clase II, y ello para cualquier individuo.

Recientemente, Gilboa et al. (Boczkowsky et al., 1996) han podido demostrar que unos ARN mensajeros preparados a partir de biopsias de tumores cargados en las células dendríticas pueden tener un efecto antitumoral in vivo. Sin embargo, los ARN son muy inestables y la cantidad de ARN potencialmente interesante comparado con el ARN total es verosímilmente muy baja. Zitvogel et al., (Zitvogel et al., 1996 [b]) han demostrado que los péptidos tumorales preparados a partir de un eluado ácido de tumores (eluado peptídico ácido: EPA) pueden ser utilizados para cargar unas células dendríticas. Estas células así cargadas, una vez inyectadas, tienen la capacidad de hacer remitir unos tumores. Sin embargo, en el caso de tumores que no expresan moléculas de clase I (que representan la mayoría de los tumores humanos metastásicos), o en el caso de tumores que no pueden ser disociados en una suspensión celular, la aproximación que utiliza los eluados ácidos no es muy eficaz y no es reproducible.

Una segunda limitación de la inmunoterapia basada en el empleo de células dendríticas está ligada a los cambios fenotípicos que pueden sobrevenir cuando estas células son mantenidas en cultivo, o sometidas a diferentes tratamientos. Esto puede en efecto conducir a unas poblaciones celulares poco homogéneas e insuficientemente caracterizadas para un uso terapéutico.

Existe por tanto una necesidad real de mejorar los procedimientos de sensibilización de las células presentadoras de antígenos, con el fin de aumentar la eficacia de estas aproximaciones y ensanchar sus aplicaciones, así como elaborar nuevos medios de vectorización de antígenos u otras moléculas.

La presente invención aporta unas soluciones a estas cuestiones. La presente invención tiene en efecto por objetivo proporcionar nuevos procedimientos de sensibilización de células presentadoras de antígeno, en particular de las células dendríticas, así como la identificación, el aislamiento y la caracterización de las nuevas vesículas membranarias que tienen propiedades inmunógenas destacables.

Uno de los aspectos de la invención es más particularmente proponer un nuevo procedimiento reproducible de sensibilización de células presentadoras de antígeno por unos antígenos tumorales.

Uno de los otros aspectos de la invención es proponer un nuevo procedimiento reproducible de sensibilización de células presentadoras de antígeno por unos antígenos tumorales, en el cual no es necesario que los antígenos tumorales sean conocidos.

Otro aspecto es proponer los medios que permitan establecer un banco de antígenos tumorales.

Otro aspecto de la invención reside en unas vesículas membranarias, lipídicas producidas por las células dendríticas y dotadas de propiedades inmunógenas, así como su utilización para la producción de bancos de antígenos, la sensibilización de células presentadoras de antígenos o la vectorización de antígenos, en particular en el marco de aproximaciones inmunoterapéuticas.

A este respecto, un primer objeto de la invención se refiere a una vesícula derivada de células tumorales que tienen las características siguientes: