VARIANTES DE PROTEASA CON MULTIPLES SUSTITUCIONES.
Variante de subtilisina 309 o subtilisina PB92, que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos V4E/N76D/S103A/V104I en las posiciones de restos que corresponden a las de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
en la que dicha proteasa variante tiene un mejor rendimiento de lavado comparado con la subtilisina 309 o subtilisina PB92 en un sistema de concentración baja de detergente
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05015947.
Solicitante: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.
THE PROCTER AND GAMBLE COMPANY.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 925 PAGE MILL ROAD,PALO ALTO, CALIFORNIA 94304.
Inventor/es: POULOSE, AYROOKARAN, J., SCHELLENBERGER, VOLKER, PAECH, CHRISTIAN, NADHERNY, JOANNE, BAECK, ANDRE, C., KELLIS,JAMES T,JR.,GENENCOR INTERNATIONAL,INC, NAKI,DONALD P.,C/O GENENCOR INTERNATIONAL,INC, COLLIER,KATHERINE D.,C/O GENENCOR INT.,INC, CALDWELL,ROBERT M.,C/O GENENCOR INT.,INC.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 23 de Octubre de 1998.
Fecha Concesión Europea: 7 de Octubre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A23G4/12M
- A23K1/165B
- A61K8/66 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 8/00 Cosméticos o preparaciones similares para el aseo. › Enzimas.
- A61Q11/00 A61 […] › A61Q USO ESPECIFICO DE COSMETICOS O DE PREPARACIONES SIMILARES PARA EL ASEO. › Preparaciones para el cuidado de los dientes, la cavidad bucal o la dentadura, p.ej. dentífricos o pasta dental; Colutorios.
- A61Q19/00 A61Q […] › Preparaciones para el cuidado de la piel.
- C11D3/386 QUIMICA; METALURGIA. › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
- C11D3/386A
- C11D3/386B
- C12N9/54 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › siendo las bacterias del género Bacillus.
Clasificación PCT:
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Rumania, Chipre.
Fragmento de la descripción:
Variantes de proteasa con múltiples sustituciones.
Antecedentes de la invención
Las serina proteasas son un subgrupo de carbonil hidrolasas. Comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una amplia variedad de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R., Sci. Amer., 131: 74-88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serina proteasas se ha enfocado a al menos dos familias genéticamente distintas de enzimas: 1) las subtilisinas y 2) las serina proteasas bacterianas homólogas y relacionadas con qumiotripsina de mamífero (p. ej., tripsina y tripsina de S. gresius). Estas dos familias de serina proteasas presentan mecanismos de catálisis notablemente similares. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46:331-358. Además, aunque la estructura primaria no está relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas lleva en ambas una tríada catalítica conservada de aminoácidos que consiste en serina, histidina y aspartato.
Las subtilisinas son serina proteasas (PM aprox. 27.500) que son segregadas en grandes cantidades de una amplia variedad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia de proteína de la subtilisina se ha determinado de al menos 9 especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., y col. (1983), Hoppe-Seyler's Z., Physiol. Chem., 364: 1537-1540. Se ha publicado la estructura cristalográfica tridimensional de las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenilorimis y varias variantes naturales de B. lentus. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está genéticamente relacionada con las serina proteasas de mamíferos, tiene una estructura del sitio activo similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de subtilisinas que contienen inhibidores peptídicos covalentemente unidos (Robertus, J.D., y col. (1972), Biochemistry, 11: 2439-2449) o complejos del producto (Robertus, J.D., y col. (1976), J. Biol. Chem., 251: 1097-1103) también han proporcionado información relacionada con el sitio activo y la hendidura de unión del sustrato putativo de la subtilisina. Además, se ha llevado a cabo la mutagénesis específica de sitio extensiva (Wells y Estell (1988) TIBS 13: 291-297).
El documento WO95/10615 describe variantes de proteasas subtilisina que tiene mejores propiedades, incluyendo un mutante específico que tiene las sustituciones N76D/S103A1V1041.
El documento WO91/00345 propone la hipótesis de que el rendimiento de lavado de una proteasa subtilisina se puede mejorar moviendo su punto isoeléctrico hacia el pH de las aguas madre.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una variante de la proteasas subtilisina 309 o subtilisina PB92, que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos
en las posiciones de restos que corresponden a las de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, en el que dicha variante de proteasa tiene un mejor rendimiento de lavado comparado con la subtilisina 309 o subtilisina PB92 en un sistema de concentración baja de detergente.
La invención también proporciona un procedimiento para mejorar el rendimiento de lavado de una proteasa subtilisina de Bacillus lentus, tal como la proteasa subtilisina 309 o subtilisina PB92, que comprende introducir un conjunto de sustituciones de los aminoácidos
en las posiciones de restos que corresponden a las de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para generar una proteasa variante, en el que dicha proteasa variante tiene un mejor rendimiento de lavado comparado con dicha proteasa subtilisina de Bacillus lentus en un sistema de concentración baja de detergente.
La variante de proteasa puede comprender el conjunto de sustituciones:
La invención también proporciona un ADN que codifica variantes de proteasa como se han descrito antes, así como un vector de expresión que contiene dicha secuencia de ADN, y una célula huésped transformada con dicho vector de expresión, así como procedimientos para generarlo.
La invención también proporciona una composición de limpieza o una composición para tratar un producto textil, que comprende la variante de proteasa de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1 A-C. Representan el ADN y la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen.
Figura 2. Representa los restos de aminoácidos conservados entre las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y Bacillus lentus (tipo salvaje).
Figuras 3A y 3B. Representan la secuencia de aminoácidos de 4 subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (denominada a veces también subtilisina BPN'). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus subtilis. La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis. La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (también denominada subtilisina 309 en el documento PCT WO89/06276). El símbolo indica la ausencia de restos de aminoácidos específicos comparado con la subtilisina BPN'.
Descripción detallada de la invención
Las proteasas son carbonil hidrolasas que en general actúan para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se usa en el presente documento, "proteasa" significa una proteasa natural o una proteasa recombinante.
En el presente documento se describen enzimas proteasas que son variantes de proteasas subtilisinas no naturales, que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o características de rendimiento diferentes comparadas con el precursor de la proteasa subtilisina de la cual deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente, dichas variantes tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se obtiene por sustitución de una pluralidad de restos de aminoácidos de una proteasa precursora con diferentes aminoácidos. La proteasa precursora puede ser una proteasa natural o una proteasa recombinante.
A lo largo de esta memoria descriptiva se hace referencia a diferentes aminoácidos mediante los códigos de una y tres letras habituales. Dichos códigos están identificados en Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Apéndice B.
Las variantes de proteasa útiles en el presente documento se obtienen de la subtilisina de Bacillus lentus. Más preferiblemente, las variantes de proteasa se obtienen de la subtilisina PB92 y/o subtilisina 309.
Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que en general actúan para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se usa el en presente documento, "subtilisina" significa una subtilisina natural o una subtilisina recombinante. Se sabe que una serie de subtilisinas naturales son producidas y a menudo secretadas por diferentes especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son completamente homólogas. Sin embargo, las subtilisinas de esta serie presentan el mismo tipo o similar de actividad proteolítica. Esta clase de serina proteasas comparten una secuencia común de aminoácidos que definen una tríada catalítica que las distingue de la clase de serina proteasas relacionadas con quimiotripsina. Tanto las subtilisinas como las serina proteasas relacionadas con quimiotripsina tienen una tríada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con subtilisina, el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el extremo amino al carboxi, es aspartato-histidina-serina. Sin embargo, en las proteasas relacionadas con quimiotripsina, el orden relativo, es histidina-aspartato-serina. Por lo tanto, subtilisina, en el presente documento, se refiere a una serina proteasa que tiene la tríada catalítica de las proteasas relacionadas con subtilisina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a las subtilisinas identificadas en la figura 3 en...
Reivindicaciones:
1. Variante de subtilisina 309 o subtilisina PB92, que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos
en las posiciones de restos que corresponden a las de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, en la que dicha proteasa variante tiene un mejor rendimiento de lavado comparado con la subtilisina 309 o subtilisina PB92 en un sistema de concentración baja de detergente.
2. Variante de proteasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el conjunto de sustituciones:
3. ADN que codifica una variante de proteasa de la reivindicación 1 o reivindicación 2.
4. Vector de expresión que comprende el ADN de la reivindicación 3.
5. Célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 4.
6. Composición de limpieza o composición para tratar un producto textil, que comprende la variante de proteasa de la reivindicación 1 o reivindicación 2.
7. Procedimiento para mejorar el rendimiento de lavado de una proteasa subtilisina de Bacillus lentus, que comprende introducir un conjunto de sustituciones de los aminoácidos
en las posiciones de restos que corresponden a las de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para generar una proteasa variante, en la que dicha proteasa variante tiene un mejor rendimiento de lavado comparado con dicha proteasa subtilisina de Bacillus lentus en un sistema de concentración baja de detergente.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende introducir un conjunto de sustituciones:
9. Procedimiento según la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que dicha proteasa subtilisina de Bacillus lentus es la subtilisina 309 o subtilisina PB92.
10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende generar un ADN que codifica dicha variante de proteasa.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende generar un vector de expresión que comprende dicho ADN.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, que comprende generar una célula huésped transformada con dicho vector de expresión.
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