Un método para preparar Birnavirus vivos, en donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV),

que comprende los siguientes pasos:

- preparar ADNc de los segmentos A y B del genoma del Birnavirus,

- transcribir dichos ADNc para producir transcritos sintéticos de ARN, en donde dichos transcritos de ARN son transcritos de ARN de sentido positivo de dichos segmentos A y B,

- transfectar células huésped con dichos transcritos sintéticos de ARN, incubar dichas células huésped en un medio de cultivo, y

- aislar el Birnavirus infeccioso vivo de dicho medio de cultivo

Un método para generar virus de la bursitis infecciosa a partir de transcritos sintéticos de ARN.

Antecedentes de la invención

El virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un miembro de la familia Birnaviridae, es el agente causante de una enfermedad altamente inmunosupresora en pollos jóvenes (Kibenge, F.S.B., et al., J. Gen. Virol., 69, 1757-1775 (1988)). La bursitis infecciosa (IBD) o enfermedad de Gumboro se caracteriza por la destrucción de los folículos linfoides en la bolsa de Fabricio. En una bandada de pollos totalmente susceptible de 3-6 semanas de edad la enfermedad clínica produce inmunosupresión grave y es responsable de pérdidas debidas al crecimiento disminuido, descenso en la eficacia de la alimentación y muerte. Los pollos susceptibles de menos de 3 semanas de edad no muestran signos clínicos externos de la enfermedad pero tienen una marcada infección caracterizada por enormes lesiones de la bolsa.

El virus asociado con los síntomas de la enfermedad se denomina virus de la bursitis infecciosa (IBDV). El IBDV es un patógeno de máxima importancia económica para las industrias avícolas nacionales y mundiales. Produce inmunodeficiencia grave en pollos jóvenes mediante la destrucción de precursores de células B productoras de anticuerpos en la bolsa de Fabricio. La inmunosupresión produce aumento de la susceptibilidad a otras enfermedades e interfiere con la vacunación eficaz contra los virus de la enfermedad de Newcastle, la enfermedad de Marek y la bronquitis infecciosa.

Hay dos serotipos conocidos de IBDV. Los virus de serotipo I son patogénicos para pollos mientras que los virus de serotipo II infectan pollos y pavos. La infección de pavos es actualmente de significancia clínica desconocida.

El IBDV pertenece a un grupo de virus denominados Birnaviridae que incluye otros virus de ARN bisegmentado tales como el virus de la necrosis pancreática infecciosa (peces), virus de tellina y virus de ostra (moluscos bivalvos) y virus X de drosophila (mosca de la fruta). Estos virus contienen todos genomas de ARN bicatenario de alto peso molecular (MW).

La cápside del virión de IBDV consiste en varias proteínas estructurales. Se han descrito hasta nueve proteínas estructurales pero hay evidencia de que algunas de estas pueden tener relación precursor-producto (Kibenge, F.S.B., et al., J. Gen. Virol., 69, 1757-1775 (1988)). La designación y pesos moleculares de las proteínas víricas (VP) son como se muestra a continuación

Se identificaron dos segmentos de ARN bicatenario en el genoma de IBDV. El genoma de IBDV consiste en dos segmentos de ARN(bc) bicatenario que varían entre 2827 (segmento B) y 3261 (segmento A) pares de bases de nucleótidos (Mundt, E. et al., Virology, 209, 10-18 (1995)). El segmento A más largo codifica una poliproteína que se corta por autoproteolisis para formar las proteínas víricas maduras VP2, VP3 y VP4 (Hudson, P.J. et al., Nucleic Acids Res., 14, 5001-5012 (1986)). VP2 y VP3 son las proteínas estructurales principales del virión. VP2 es el principal inmunógeno protector del huésped de IBDV y contiene las regiones antigénicas responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes (Azad, et al., Virology, 161, 145-152 (1987)). Un segundo marco abierto de lectura (ORF), que precede y parcialmente se solapa con el gen de la poliproteína, codifica una proteína (VP5) de función desconocida que está presente en células infectadas con IBDV (Mundt, E., et al., J. Gen. Virol., 76, 437-443, (1995)). El fragmento menor B codifica VP1, una proteína multifuncional de 90 kDa con actividades enzimáticas de polimerasa y de protección terminal (Spies, U., et al., Virus Res., 8, 127-140 (1987); Spies, U., et al., J. Gen. Virol., 71, 977-981 (1990)).

Se ha demostrado que la proteína VP2 es el principal inmunógeno protector del huésped de IBDV y que contiene la región antigénica responsable de la inducción de anticuerpos neutralizantes. Se ha mostrado que la región que contiene el sitio de neutralización depende mucho de la conformación. Se ha considerado que la proteína VP3 es un antígeno específico de grupo porque es reconocida por anticuerpos monoclonales dirigidos contra ella de cepas tanto de virus de serotipo I como II. Parece que la proteína VP4 es una proteasa codificada por el virus que está implicada en el procesamiento de una poliproteína precursora de las proteínas VP2, VP3 y VP4.

Aunque se han publicado las secuencias de nucleótidos para los segmentos genómicos A y B de varias cepas de IBDV, sólo recientemente se determinaron las secuencias 5' y 3' no codificantes de ambos segmentos. La región 5' no codificante de los segmentos A y B de IDBV contiene una secuencia consenso de 32 nucleótidos, mientras que las secuencias terminales 3' no codificantes de ambos segmentos no están relacionadas, pero se conservan entre cepas de IBDV del mismo serotipo (Mundt, E. et al., Virology, 209, 10-18 (1995)). Estos extermos terminales podrían contener secuencias importantes en empaquetamiento y en la regulación de la expresión génica de IBDV, como se ha demostrado para otros virus que contienen ARNbc tales como reovirus de mamíferos y plantas y rotavirus (Anzola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8301-8305 (1987); Zou, S., et al., Virology, 186, 377-388 (1992); Gorziglia, M.I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5784-5788 (1992)).

En los últimos años, se han generado ciertos virus ARN infecciosos de animales a partir de ADNc clonado usando transcritos producidos por ARN polimerasa dependiente de ADN (Boyer, J.C., et al., Virology, 198, 415-426 (1994)). Por ejemplo poliovirus, un virus ARN de cadena positiva; virus de la gripe, un virus ARN segmentado de cadena negativa; virus de la rabia, un virus ARN no segmentado de cadena negativa; todos se recuperaron de ADNc clonados de sus respectivos genomas (van der Werf S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2330-2334 (1986); Enami, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990); Schnell, M.J., et al., EMBO J., 13, 4195-4205 (1994)). Para reovirus, se mostró que la transfección de células con una combinación de ARNmc, ARNbc y productos de reovirus traducidos in vitro generó reovirus infecciosos cuando se complementaron con un virus auxiliar de un serotipo diferente (Rover, M.R., et al., Virology, 179, 845-852 (1990)). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha descrito un virus infeccioso recuperado de genoma de ARNbc segmentado a partir de ARN sintéticos sólo.

Compendio de la invención

Esta invención se refiere al virus de la bursitis infecciosa (IBDV) que está asociado con la enfermedad de Gumboro de pollos jóvenes. Más en particular, esta invención se refiere a un sistema para la generación de virus de la bursitis infecciosa (IBDV) usando transcritos sintéticos derivados de ADNc clonado. La presente invención facilitará estudios de la regulación de la expresión génica vírica, patogénesis y diseño de una nueva generación de vacunas vivas e inactivadas.

Descripción detallada de la invención

En un esfuerzo para desarrollar un sistema de genética inversa para IBDV, se construyeron tres clones independientes de ADNc de longitud total que contienen el segmento A de la cepa D78 del serotipo I o la cepa 23/82 del serotipo II y el segmento B de la cepa P2 del serotipo I, respectivamente. Los ARN sintéticos de los segmentos A y B se produjeron mediante reacción de transcripción in vitro de plásmidos linearizados con ARN polimerasa de T7. Los transcritos de estos segmentos, bien sin tratar o tratados con DNasa o RNasa, se evaluaron para la generación de virus infecciosos mediante la transfección de células Vero.

Los inventores presentes han demostrado que los transcritos sintéticos derivados de ADN clonado correspondiente al genoma completo de un virus animal de ARNbc segmentado pueden dar lugar a un virus replicante. La recuperación de virus infeccioso después de transfectar células con ARN sintéticos de sentido positivo derivados de ADNc de un virus con un genoma de ARNbc (IBDV) completa la búsqueda de generar sistemas infecciosos inversos para virus de ARN. Un número de investigadores han generado virus ARN infecciosos de animales a partir de ADN clonado (Boyer, J.C., et al., Virology, 198, 415-426 (1994))....

1. Un método para preparar Birnavirus vivos, en donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), que comprende los siguientes pasos:

2. El método según la reivindicación 1, en donde dichas células huésped son células Vero de mono verde africano.

3. Un método para preparar Birnavirus quiméricos vivos, en donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), el método comprende los pasos del método de la reivindicación 1, en donde en el primer paso dichos ADNc de los segmentos A y B del genoma de Birnavirus se preparan de forma independiente a partir de diferentes cepas de Birnavirus.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicho segmento A está presente en los plásmidos de SEQ ID NO: 27 y 29, o en SEQ ID NO: 31 y 33.

5. El método según la reivindicación 3, en donde dicho segmento B está presente en el plásmido de SEQ ID NO: 25.

6. Un plásmido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 y 33.

7. Un método para preparar una vacuna contra IBDV que comprende un IBDV quimérico vivo, dicho método comprende el paso de mezclar el IBDV quimérico vivo obtenible mediante el método de la reivindicación 3 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. El método según la reivindicación 7, en donde el IBDV quimérico está inactivado.

9. El método según la reivindicación 8, en donde la inactivación del IBDV quimérico vivo se alcanza mediante inactivación química.

10. El método según la reivindicación 8, en donde la inactivación del IBDV quimérico vivo se alcanza mediante sometimiento a radiación seleccionada de entre luz UV, radiación X y radiación ?.

11. Una vacuna para la protección de aves de corral contra IBDV, que comprende un IBDV quimérico vivo obtenible mediante el método de la reivindicación 3.

12. La vacuna según la reivindicación 11, en donde dicho IBDV está inactivado.

13. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende además un estabilizante.

14. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, que comprende además un adyuvante.

15. Uso de un IBDV quimérico vivo obtenible mediante el método de la reivindicación 3, para la fabricación de una vacuna para la protección de aves de corral contra IBDV.