TRANSFORMACION MEDIADA POR "BIGOTES" DE CULTIVOS EMBRIOGENICOS EN SUSPENSION DE ALGODON.

Método para transformar una célula de algodón en un cultivo embriogénico de algodón en suspensión que comprende:

introducir el ADN en dicha célula por la transformación mediante bigotes

Transformación mediada por "bigotes" de cultivos embriogénicos en suspensión de algodón.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para utilizar microfibras aciculares alargadas, o "bigotes", para transformar cultivos embriogénicos en suspensión de algodón.

Antecedentes de la invención

Hasta hace poco, las plantas manipuladas genéticamente se limitaban casi exclusivamente a los fenómenos creados con la aplicación de los métodos de reproducción clásicos. La creación de nuevas variedades vegetales mediante mejora genética se reservó principalmente para los cultivos más importantes desde el punto de vista agronómico, tales como el maíz, debido al coste y al tiempo necesario para identificar, cruzar y fijar de manera estable un gen en el genoma, para así crear el rasgo deseado. En comparación, la llegada de la ingeniería genética ha dado lugar a la introducción de muchos genes heterólogos diferentes y las consiguientes características en distintos cultivos, que incluyen maíz, algodón, soja, trigo, arroz, girasol y colza, de un modo más rápido. Sin embargo, la introducción de un nuevo transgén en el germoplasma de élite es todavía una tarea laboriosa debido al cultivo del tejido y al retrocruzamiento necesario para producir una estirpe de élite comercialmente viable.

Existen varias técnicas que permiten la introducción, la regeneración de la planta, la integración estable y la expresión de vectores recombinantes foráneos que contienen genes heterólogos de interés en las células vegetales. Tal técnica implica la aceleración de micropartículas recubiertas con material genético directamente al interior de las células vegetales (patentes de los EE.UU. n.º 4.945.050 de Cornell; n.º 5.141.131 de DowElanoco; y n.º 5.538.877 y 5.538.880, ambas de Dekalb). Esta técnica se cita normalmente como "bombardeo con partículas" o "biolística". También se pueden transformar las plantas mediante la tecnología de Agrobacterium (patentes de los EE.UU. n.º 5.177.010 de la Universidad de Toledo, n.º 5.104.310 de la Texas A&M, solicitud de patente europea n.º 0131624B1, solicitudes de patente europea n.º 120516, n.º 159418B1 y n.º 176.112 de Schilperoot, patentes de los EE.UU. n.º 5.149.645, n.º 5.469.976, n.º 5.464.763 y n.º 4.940.838 y n.º 4.693.976 de Schilperoot, solicitudes de patente europea n.º 116718, n.º 290799, n.º 320500 todas del Instituto Max Planck, solicitudes de patente europea n.º 604662, n.º 627752 y patente de los EE.UU. n.º 5.591.616 de Japan Tobacco, solicitudes de patente europea n.º 0267159 y n.º 0292435 y patente de los EE.UU. n.º 5.231.019 todas de Ciba-Geigy, patentes de los EE.UU. n.º 5.463.174 y n.º 4.762.785 ambas de Calgene, y las patentes de los EE.UU. n.º 5.004.863 y n.º 5.159.135 ambas de Agracetus). Otro método de transformación implica la utilización de microfibras aciculares alargadas o "bigotes" para transformar cultivos en suspensión de células de maíz (patentes de los EE.UU. n.º 5.302.523 y n.º 5.464.765 ambas de Zeneca). Además, se ha utilizado la tecnología de electroporación para transformar las células vegetales a partir de las cuales se han obtenido plantas fértiles (patente internacional WO 87/06614 del Boyce Thompson Institute; n.º 5.472.869 y n.º 5.384.253 ambas de Dekalb; n.º 5.679.558, n.º 5.641.664, patentes internacionales WO 9209696 y WO 9321335 de Plant Genetic Systems).

A pesar de todos los logros técnicos, todavía es una tarea laboriosa la transformación genética y la producción sistemática de las plantas transgénicas en un germoplasma de élite y comercialmente viable. Por ejemplo, el bombardeo con micropartículas, aunque se pueda utilizar tanto en células individuales como en agregados celulares o en tejidos vegetales, requiere preparar partículas de oro unidas a ADN y optimizar un aparato "disparador" caro y que todavía no está ampliamente distribuido. Las técnicas que utilizan Agrobacterium están muy limitadas porque no todas las especies vegetales, o variedades dentro de una especie determinada, son susceptibles de ser infectadas por la bacteria. No son preferentes las técnicas de electroporación debido a las dificultades y coste extremos encontrados normalmente en la fabricación sistemática de protoplastos de diferentes especies y tejidos vegetales de las mismas, y la baja viabilidad concomitante y la baja tasa de transformación asociada a estas.

Se puede introducir el ADN heterólogo en cultivos de células vegetales regenerables a través de la transformación mediante bigotes. Aunque se puede encontrar una descripción general del procedimiento en las patentes de los EE.UU. n.º 5.302.523 y n.º 5.464.765, ambas de Zeneca, no se ha publicado ningún protocolo hasta la fecha para la transformación mediante bigotes de cultivos embriogénicos de algodón.

La patente internacional WO 99/38979 describe la transformación de callos de algodón mediante bigotes, pero no describe ni sugiere la transformación mediante bigotes de los cultivos embriogénicos en suspensión de algodón.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a la producción de plantas de Gossypium hirsutim L. transgénicas y fértiles que contienen ADN heterólogo integrado preferentemente en el cromosoma de dicha planta y heredable por la progenie de las mismas.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a plantas de Gossypium hirsutum L, partes de la planta, fibras vegetales, células vegetales, agregados de células vegetales y semillas obtenidas de plantas transgénicas que contienen dicho ADN heterólogo. La invención produce las plantas transgénicas fértiles descritas en la presente memoria por medio de la perforación de las células con los bigotes y la captación del ADN heterólogo, realizándose dicha perforación de células mediante bigotes en cultivos embriogénicos en suspensión de algodón.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y características de la presente invención resultarán evidentes a partir de la especificación siguiente.

Descripción detallada de la invención

Las frases y terminología que sigue se definen a continuación:

Mediante "antisentido" se quiere hacer referencia a un ARN transcrito que comprende secuencias complementarias a un ARN y/o ARNm diana o porciones de los mismos que bloquean la expresión de un gen diana al interferir con el procesamiento, transporte y/o traducción de su transcrito primario y/o ARNm. Puede existir complementariedad con cualquier parte del ARN diana, es decir, la secuencia no codificante en 5', la secuencia no codificante en 3', los intrones o la secuencia codificante. El ARN antisentido es normalmente un complemento (imagen especular) del ARN sentido.

Mediante "ADNc" se quiere hacer referencia al ADN que es complementario a un ARNm y se deriva de él.

Mediante "construcción de ADN quimérico" se quiere hacer referencia a un ADN recombinante que contiene genes o porciones de los mismos de una o más especies tanto en la orientación sentido como la antisentido.

Mediante "promotor constitutivo" se quiere hacer referencia a los elementos del promotor que dirigen la expresión génica continua en todos los tipos celular y en todo momento (por ejemplo, actina, ubicuitina, CaMV 35S, 35T y similares).

Mediante "cosupresión" se quiere hacer referencia a la introducción de un gen foráneo que mantiene una homología sustancial con un gen endógeno, y que en una célula vegetal ocasiona la reducción en la actividad del producto del gen foráneo y/o el gen endógeno. A veces se puede lograr la cosupresión al introducir en dicha célula vegetal bien la secuencia del promotor, bien los extremos 5' y/o 3', bien los intrones o bien la región codificante de un gen.

Por promotor "específico del desarrollo" se quiere hacer referencia a los elementos del promotor responsables de la expresión del gen en determinadas etapas de desarrollo de la planta, como la embriogénesis temprana o tardía y similares.

Mediante "potenciador" se quiere hacer referencia a los elementos de la secuencia nucleotídica que pueden estimular la actividad de los promotores, tales como los del virus del rayado del maíz (MSV), del virus del mosaico de la alfalfa (AMV), del intrón 1 de la alcohol deshidrogenasa y similares.

Mediante "expresión", tal y como se utiliza en la presente memoria, se quiere hacer referencia a la transcripción de moléculas enzimáticas de ácido nucleico, ARNm y/o el ARN antisentido dentro de una célula vegetal....

1. Método para transformar una célula de algodón en un cultivo embriogénico de algodón en suspensión que comprende: introducir el ADN en dicha célula por la transformación mediante bigotes.

2. Método para producir una planta transgénica fértil que comprende regenerar una célula producida por el método de la reivindicación 1.

3. Método para producir una planta transgénica fértil que comprende las etapas de: i) establecer un cultivo embriogénico de algodón en suspensión; ii) transformar al menos una célula de algodón en dicho cultivo en suspensión con ADN por la transformación mediante bigotes; iii) identificar las estirpes celulares transformadas derivadas de ella; y iv) regenerar las plantas transgénicas fértiles derivadas de ellas.