Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en la región del bucle bicatenario

Toxinas clostridiales activables por toxinas clostridiales.

La presente solicitud de patente reivindica prioridad conforme a 35 U.S.C. NAK119(e) respecto de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 60/718.616 presentada el 19 de septiembre de 2005.

La capacidad de las toxinas clostridiales, tales como, p. ej., las neurotoxinas botulínicas (BoNT) BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, la neurotoxina tetánica (TeNT), la neurotoxina de C. Baratii (BaNT) y la neurotoxina butírica (BuNT), para inhibir la transmisión neuronal se está explotando en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, p. ej., William J. Lipham, "COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN" (Slack, Inc., 2004). Las toxinas clostridiales comercialmente disponibles como composiciones farmacéuticas incluyen las preparaciones de BoNT/A, tales como, p. ej., BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA), Dysport®/Reloxin®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Inglaterra), Linurase® (Prollenium, Inc., Ontario, Canadá), Neuronox® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur), BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y Xeomin® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania); y las preparaciones de BoNT/B, tales como, p. ej., MyoBloc^TM/NeuroBloc^TM (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Como ejemplo, el BOTOX® está aprobado en la actualidad en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxomanía, distonía cervical, temblor esencial, líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno nervioso VII.

El creciente uso de terapias con toxinas clostridiales en el tratamiento de una amplia selección de dolencias del ser humano hace necesario aumentar la eficiencia con la que se producen estas toxinas. Sin embargo, puede resultar difícil cubrir las necesidades de la creciente demanda de tales tratamientos con toxinas. Un problema por resolver es la necesidad de convertir todas las toxinas clostridiales en la forma bicatenaria de la molécula para conseguir una actividad óptima. Históricamente, esta conversión se ha hecho en uno de estos dos modos. El primer procedimiento simplemente purifica una toxina clostridial de la propia cepa bacteriana, basándose, de ese modo, en la proteasa endógena natural usada para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. El segundo procedimiento utiliza una proteasa exógena que convierte la forma monocatenaria en la cadena doble, bien aprovechando un sitio de escisión fortuito encontrado en la ubicación apropiada o mediante el diseño genético de un sitio de escisión por proteasa de las proteasas exógenas comercialmente disponibles que se usan habitualmente. Sin embargo, ambos procedimientos presentan varias desventajas. Por ejemplo, los procedimientos que emplean una proteasa endógena tienen bajos rendimientos de toxina, porque las cepas clostridiales nativas habitualmente producen poca toxina. Además, estas cepas son poco apropiadas para la investigación, dificultando así los esfuerzos por mejorar las características terapéuticas y cosméticas de las toxinas clostridiales sometidas a manipulación genética. Por último, hay varias cepas clostridiales que no producen la proteasa endógena necesaria para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. Una desventaja del uso de proteasas exógenas es la falta de especificidad de la proteasa que da como resultado toxina inactiva debido a la escisión proteolítica de ubicaciones inapropiadas. Además, muchas de las proteasas actualmente disponibles proceden de fuentes animales que no cumplen las normas de correcta fabricación (NCF), por lo que requieren más etapas de purificación durante el procedimiento de fabricación. De este modo, los procedimientos usados actualmente para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria son ineficaces, incómodos de realizar y conducen a unos costes globales de producción mayores. Estas desventajas representan un obstáculo relevante para la producción comercial a escala global de las toxinas clostridiales y constituyen, por tanto, un problema muy importante, pues las formas bicatenarias de estas toxinas son necesarias para aplicaciones científicas, terapéuticas y cosméticas. Además, están en aumento tanto la cantidad de toxinas clostridiales que se prevé para futuras terapias como la demanda de toxinas con mayores propiedades terapéuticas. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar mejores procedimientos para generar moléculas bicatenarias de toxinas clostridiales para cubrir esta necesidad.

La presente invención proporciona toxinas clostridiales modificadas que se basan en un nuevo procedimiento para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. Éstas y otras ventajas relacionadas son útiles para diversas aplicaciones clínicas, terapéuticas y cosméticas, tales como, p. ej., el tratamiento de trastornos neuromusculares, trastornos neuropáticos, trastornos oculares, dolor, daños musculares, dolor de cabeza, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurosiquiátricos, trastornos endocrinos, cánceres, trastornos óticos y líneas faciales hipercinéticas, así como otros trastornos en los que la administración de toxinas clostridiales a un mamífero puede producir un efecto beneficioso.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra un esquema del paradigma actual del procesamiento posterior a la traducción de las toxinas clostridiales. Las toxinas clostridiales son traducidas en forma de un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión. Un enlace disulfuro formado desde un residuo de cisteína del dominio enzimático y un residuo de cisteína del dominio de translocación forma un bucle bicatenario. En este bucle bicatenario hay un sitio de escisión por proteasa para una proteasa natural que puede ser producida endógenamente desde la cepa clostridial que sintetiza la toxina, o exógenamente desde una fuente encontrada en el medio ambiente. La escisión del sitio de escisión por proteasa por parte de la proteasa natural convierte la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. La forma bicatenaria de la toxina se mantiene unida por el enlace tipo disulfuro y las interacciones no covalentes que hay entre las dos cadenas.

La Fig. 2 muestra un esquema del paradigma actual de la liberación de neurotransmisores y la intoxicación con toxinas clostridiales en una neurona central y periférica. La Fig. 2a muestra un esquema del mecanismo de la liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación se puede describir como aquél que comprende dos etapas: 1) acoplamiento de la vesícula, en el que la proteína SNARE unida a una vesícula que contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con las proteínas SNARE de unión a la membrana ubicadas en la membrana plasmática; 2) liberación de neurotransmisores, en la que la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas neurotransmisoras son sometidas a exocitosis. La Fig. 2b muestra un esquema del mecanismo intoxicación por la actividad de las toxinas tetánica y botulínica de una neurona central y periférica. El proceso de intoxicación se puede describir como aquél que comprende cuatro etapas: 1) unión a un receptor, en la que la toxina clostridial se une a un sistema receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) interiorización del complejo, en el que tras la unión de la toxina, una vesícula que contiene el complejo de toxina/sistema receptor es sometida a endocitosis dentro de la célula; 3) translocación de la cadena ligera, en la que múltiples hechos dan lugar a la liberación de la cadena ligera activa dentro del citoplasma; y 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera activa de la toxina clostridial escinde proteolíticamente su sustrato de SNARE diana, tal como, p. ej., SNAP-25, VAMP o sintaxina, evitando así el acoplamiento de la vesícula y la liberación de neurotrans- misores.

La Fig. 3 muestra un esquema de la ubicación subcelular y los sitios de escisión de la SNAP-25, VAMP y sintaxina. La VAMP se ubica en la membrana de la vesícula sináptica, mientras que la SNAP-25 y la sintaxina se ubican en la membrana plasmática. BoNT/A y BoNT/E escinden...

1. Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en la región del bucle bicatenario.

2. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.

3. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.

4. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial se obtiene de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.

5. Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 1.

6. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la reivindicación 5, en la que la expresión de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 1.

7. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de:

8. Una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de translocación de toxina clostridial, un dominio de unión de toxina clostridial y una región de bucle bicatenario;

en la que la región del bucle bicatenario se interpone entre el dominio enzimático de la toxina clostridial y el dominio de translocación de la toxina clostridial; y

en la que la modificación comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado en la región del bucle bicatenario.

9. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.

10. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 9, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.

11. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial se obtiene de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.

12. Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 8.

13. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la reivindicación 12, en la que la expresión de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 8.

14. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de: