SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE A. THALIANA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DELTA-5,7-ESTEROL-DELTA-7-REDUCTASA, LA PROTEINA DELTA-7-RED, PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION, LAS CEPAS DE LEVADURAS TRANSFORMADAS, APLICACIONES.

SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE A. TALIANA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DELTA-5,

7 ESTEROL, DELTA-7 REDUCTASA(SECUENCIA SEQ ID N (GRADOS) 1). PROCEDIMIENTO DE CLONACION. PROCEDIMIENTO DE REDUCCION DE UN ESTEROL INSATURADO EN POSICION C-7. PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE PREGNENOLONA

Secuencia de ADN que codifica una proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7-esterol-delta-7-reductasa, la proteína delta-7Red, procedimiento de producción, las cepas de levaduras transformadas, aplicaciones.

La presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica una proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7-esterol-delta-7 reductasa, la proteína delta-7Red, a su procedimiento de producción, a las cepas de levaduras transformadas y a sus aplicaciones.

La delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa (E.C.1.3.1.21) es una enzima microsomal cuya presencia ha sido puesta en evidencia por su actividad en los homogenatos de hígado de rata (M. E. Dempsey et al., Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) así como en las preparaciones de plantas de Zea mays (M. Taton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465-473, 1991). Esta reductasa depende del NADPH y reduce in vitro el 7-deshidrocolesterol a colesterol.

Los esteroles son los constituyentes principales de las membranas en las eucariotas pero presentan diferencias de estructura según las especies. En las células de eucariotas tales como las levaduras, el esterol principal es el ergosterol que contiene una doble insaturación en C-5 y C-7, una cadena lateral ramificada en C-24 y una insaturación en C-22 mientras que en los mamíferos el colesterol se caracteriza por una insaturación en C-5 y una cadena lateral saturada. El sitosterol, el estigmasterol y el campesterol, que representan los esteroles más comunes en las plantas, tienen una cadena lateral ramificada pero saturada y, como los esteroles de los vertebrados, no tienen una insaturación en C-7. La enzima responsable de esta diferencia de estructura del núcleo esterol es la delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa.

La delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa no ha sido nunca purificada de modo homogéneo y solamente ha sido descrita una purificación parcial (M. E. Dempsey et al.; M. Taton et al., ya citado). La proteína no ha sido caracterizada por sus propiedades físico-químicas. No se ha descrito ninguna información sobre la secuencia de la proteína y ningún anticuerpo dirigido contra ésta. Por otro lado, una aparente deficiencia en 7-deshidrocolesterol reductasa ha sido descrita en el hombre asociada al síndrome RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994).

La clonación de un ADNc que codifica la delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, que pueda permitir identificar la secuencia de la proteína correspondiente así como la caracterización del gen humano o la puesta en evidencia de una deficiencia congénita de éste, no es por tanto realizable con los métodos conocidos que hacen uso por ejemplo de las técnicas de hibridación y/o de detección inmunológica. Por tanto es particularmente buscada la obtención de métodos inventivos de cribado que permitan realizar la clonación, especialmente en ausencia de informaciones sobre la proteína.

El ergosterol, principal esterol de las membranas de los hongos, contiene un par de dobles enlaces conjugados en C-5,7 que confiere una actividad antimicótica a los compuestos de la familia de los polienos tales como la nistatina (R. Bittman et al., J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). La fuerte dependencia de la acción de la nistatina de la concentración membranal de esteroles insaturados en C-5,7 ha permitido seleccionar en el S. cerevisiae cepas de mutantes frente a los esteroles acumulados (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Así los mutantes erg2 y erg3 acumulan esteroles que no tienen los dobles enlaces conjugados en C-5,7 debido a una deficiencia en esterol delta-8,7 isomerasa (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) y en esterol delta-5 deshidrogenasa (B. Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991) respectivamente. Tales mutantes son viables porque el ergosterol, el esterol natural principal de la levadura, puede ser reemplazado en ciertas condiciones por diferentes esteroles de sustitución incluyendo el colesterol.

La ventaja del crecimiento de la resistencia a la nistatina de cepas de levadura enriquecidas en esteroles que no tienen la doble insaturación en C-5,7 ha sido percibida por los inventores para clonar un ADNc que codifica una proteína heteróloga que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa con un método de cribado que utiliza una interferencia metabólica en S. cerevisiae. El éxito de este método que ofrece la ventaja de ser independiente del conocimiento de las secuencias del ADN o de la proteína así como de una detección basada solamente sobre la actividad enzimática, no es sin embargo previsible debido a las numerosas dificultades técnicas a superar.

Una primera limitación viene del hecho de que el modo de acción de la nistatina no está totalmente elucidado (L. W. Parks et al., CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Por ejemplo, la débil especificidad de la selección por la nistatina es previsible debido a la naturaleza indirecta de ésta que lleva en el caso de la levadura a la selección de mutaciones genómicas espontáneas tales como los mutantes erg (S. W. Molzahn et al. ya citado) o las mutaciones genómicas que arrastran resistencias independientes de la vía de los esteroles. Del mismo modo, las células transformadas por un banco pueden expresar genes heterólogos que confieren una resistencia a la nistatina sin relación con la vía de los esteroles.

Otro ejemplo de limitación esperada se refiere al hecho de que la proteína heteróloga puede ser débilmente activa en la célula, lo que conduce a la ausencia de resistencia o a una débil resistencia a la nistatina por ejemplo por una de las siguientes razones: 1) el gen que codifica la delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa está débilmente expresado; 2) la proteína es poco o nada activa porque está mal replegada o porque resulta de un tratamiento subcelular incorrecto; 3) la proteína de la planta no reconoce los esteroles propios de la levadura como sustratos o 4) los esteroles que pueden ser sustratos están en forma esterificada o almacenados en las vesículas y no están en contacto con la enzima. Se puede prever por tanto que los esteroles así acumulados escapen a la acción de la delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa que, en los eucariotas, se supone que está localizada en los microsomas.

La presente invención se refiere a la clonación de un ADNc de A. thaliana que codifica una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, denominada delta-7Red, según un procedimiento de clonación realizado en una levadura por interferencia metabólica basada sobre la resistencia a la nistatina. La proteína delta-7Red permite reducir los esteroles que tienen una insaturación en C-7 por un procedimiento de reducción biológica que proporciona además una solución ventajosa al problema de la reducción selectiva en C-7 de esteroles o de esteroides que tienen una doble insaturación en C-5,7, que los métodos de reducción por vía química no permiten.

La invención se refiere igualmente a las células de levadura transformadas que expresan la delta-7Red que, de forma sorprendente, acumulan productos saturados en C-7 y eventualmente saturados en C-22 que, contrariamente al ergosterol, son sustratos de la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol, es decir el citocromo P₄₅₀SCC.

Estas propiedades inesperadas permiten una utilización de las levaduras transformadas de la invención en un procedimiento de preparación de esteroles o de esteroides que tiene un interés industrial y/o farmacológico, en particular la preparación de pregnenolona por oxidación biológica de los esteroles endógenos de levadura, reducidos en C-7, por el citocromo P₄₅₀ SCC (P₄₅₀SCC) en presencia de adrenodoxina reductasa (ADR) y de adrenodoxina (ADX). Las levaduras transformadas de la invención se pueden utilizar también en un procedimiento de preparación de los esteroides intermedios de la vía de metabolización del colesterol en hidrocortisona en los mamíferos y otros vertebrados. Esta utilización presenta la ventaja de permitir la preparación de la hidrocortisona o de sus intermedios en un procedimiento de oxidación biológica que no necesita el empleo de un esterol exógeno tal como el colesterol como sustrato inicial y de esquivar así el problema de la penetración de un esterol en la levadura cuya impermeabilidad a los esteroles exógenos en condiciones de aerobiosis ha sido descrita (R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986).

La...

1. Una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, que presenta una identidad de secuencia de aproximadamente 60% y más con la secuencia SEQ ID Nº 1.

2. La secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico es un ADN o un ARN.

3. La secuencia de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia codificadora codifica una proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa y que tiene la secuencia nucleotídica de la secuencia SEQ ID Nº 1.

4. Una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa y que es amplificable por la técnica de PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos que codifican una secuencia de consenso que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3:

en la que Xaa en la posición 7 es Trp o Tyr y Xaa en la posición 12 es His o Lys asociados a un cebador oligo dT.

5. Una proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa y que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2.

6. La proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa que tiene una secuencia de aminoácidos que presentan una identidad de secuencia de aproximadamente 60% y más con la secuencia SEQ ID Nº 2.

7. La proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa tal como la obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. La proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa tal como la obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2.

9. La proteína según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la célula hospedadora es una levadura.

10. Un anticuerpo dirigido contra una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

11. Un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. La célula hospedadora transformada por un vector según la reivindicación 11.

13. El procedimiento de clonación de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa en un microorganismo que comprende un método de cribado elegido entre:

14. La célula hospedadora transformada según la reivindicación 12, en la que la célula hospedadora es una levadura o un hongo filamentoso.

15. Un procedimiento de preparación de una proteína que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, en el que se cultiva una célula hospedadora transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 y se aísla la proteína expresada.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el cual la célula hospedadora es una levadura transformada en la que la secuencia de ADN codificadora está puesta bajo el control de un promotor de levadura.

17. Un procedimiento de reducción in vitro de un esterol insaturado en la posición C-7, en el que se incuba el esterol a reducir con la proteína obtenida según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 y se aísla eventualmente el esterol reducido obtenido.

18. Un procedimiento de reducción in vivo de un esterol exógeno insaturado en la posición C-7, en el que se incuba el esterol con una célula hospedadora transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 y se aísla eventualmente el esterol 10 reducido obtenido.

19. El procedimiento de reducción in vivo de un esterol endógeno insaturado en la posición C-7, en el que se cultiva una cepa hospedadora transformada según la reivindicación 14 y se aísla eventualmente el esterol reducido acumulado.

20. El procedimiento de reducción in vitro o in vivo según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el esterol reducido obtenido es un sustrato de la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (P₄₅₀SCC).

21. El procedimiento de reducción in vivo según la reivindicación 20, en el que el esterol endógeno a reducir es el ergosta 5,7 dien 3-ol, el ergosta 5,7,24(28) trien 3-ol o el ergosta 5,7,22 trien 3-ol o un mezcla de estos.

22. Un procedimiento de producción de pregnenolona, en el que se cultiva una célula hospedadora transformada según la reivindicación 14, se aísla eventualmente el esterol o los esteroles endógenos reducidos en la posición C-7 acumulados, se incuban los esteroles reducidos en presencia de P₄₅₀SCC, y eventualmente de adrenodoxina reductasa (ADR) y de adrenodoxina (ADX), y se aísla eventualmente la pregnenolona obtenida.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que la célula hospedadora es una levadura.

24. Las células de levaduras transformadas que expresan una delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa.

25. La cepa de levadura transformada que coexpresa una proteína que tiene la actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, el P₄₅₀SCC, la ADR y la ADX y que acumula pregnenolona libre o esterificada.

26. La cepa de levadura según la reivindicación 25, en la que la proteína que tiene la actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa es la proteína de A. thaliana delta-7Red.

27. La cepa de levadura según la reivindicación 26, denominada BC01/pCD63 depositada en la CNCM el 10 de febrero de 1995 con el número I-1538.

28. Un procedimiento de producción de pregnenolona, en el que se cultiva una levadura transformada por uno o varios vectores que permiten la coexpresión de una proteína que tiene la actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa y de P₄₅₀SCC, y eventualmente de la ADR y de la ADX, y se aísla eventualmente la pregnenolona libre o esterificada.

29. Un procedimiento de producción de pregnenolona en el que se cultiva una levadura según la reivindicación 24.

30. El procedimiento según la reivindicación 29, en el que la proteína que tiene la actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa es la proteína de A. thaliana delta-7Red.

31. El procedimiento según la reivindicación 30, en el que la cepa de levadura es la cepa ECOI/pCD63, depositada en la CNCM el 10 de febrero de 1995 con el número I-1538.

32. Un método de detección de la deficiencia en delta-5,1 esterol-delta-7 reductasa que comprende la incubación de una muestra que contiene el ADN genómico humano con una sonda según una de las reivindicaciones 1 a 4, en condiciones de hibridación estándar y la puesta en evidencia de la fijación o de la ausencia de fijación de la sonda al ADN genómico, la ausencia de fijación o la reducción de ésta lo que indica una deficiencia congénita en delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa.