Procedimiento de muestreo, ensayo y validación de lotes de ensayo,

que comprende: a) recoger una pluralidad de porciones de cada uno de una pluralidad de lotes de ensayo, comprendiendo cada uno de los lotes de ensayo una unión de una o más muestras, en la que de cada lote de ensayo se toman muestras por separado tomando dicha pluralidad de porciones de los mismos; b) combinar las porciones recogidas correspondientes a cada uno de los lotes de ensayo separados para proporcionar una serie correspondiente de muestras de lotes de ensayo separadas, en la que cada muestra de lotes de ensayo separada se atribuye a un correspondiente lote de ensayo separado, particular; c) incubar la serie de muestras de lotes de ensayo separadas en condiciones adecuadas para permitir niveles de un agente u organismo objetivo que esté presente en una o más de las muestras de lotes de ensayo separadas para alcanzar niveles detectables y llegar a ser uniformes o sustancialmente uniformes, por la respectiva o respectivas muestras de lotes de ensayo separadas, para proporcionar una serie de muestras de lotes de ensayo enriquecidas separadas; d) retirar, asépticamente, porciones iguales de cada muestra de lotes de ensayo separada enriquecida y combinar las porciones retiradas para proporcionar una muestra de material compuesto modular y e) ensayar la muestra de material compuesto modular, usando un ensayo de detección adecuado, para el agente u organismo objetivo, en el que en el caso de que tal ensayo sea negativo se validan todas las muestras de lotes de ensayo separadas y en el que en el caso de que dicho ensayo sea positivo se pueden validar aún sin embargo los lotes de ensayo individuales por ensayo adicional de una porción de la respectiva muestra de lotes de ensayo separada, enriquecida, usando el mismo protocolo o uno más sensible y obtener un resultado de ensayo negativo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Los aspectos de la presente invención se refieren, en general, a mejorar la eficacia de la producción de alimentos y productos relacionados con la salud (por ej., productos farmacéuticos) y su seguridad y calidad. Las realizaciones particulares se refieren a procedimientos novedosos para ensayar patógenos microbianos que permitan una sensibilidad mejorada, ahorros de costes y trazabilidad (por ej., seguimiento de la fuente) para fines de recuperación. Los procedimientos son extensamente aplicables a muchas áreas de los productos incluyendo, pero sin limitación, productos de vacuno, cerdo, oveja, bisonte, ciervo, alce, aves de corral (por ej., pollo y pavo) y pescado y otros mariscos, jugos, productos lácteos, productos secos (cereales, frutos secos, etc.), frutas y verduras, hierbas y especias y todas las maneras de alimentos crudos y elaborados, muestras medioambientales (agua, agua residual, suelo, muestras superficiales, muestras de aire tomadas por burbujeos y filtración, etc.), productos farmacéuticos y otros tipos de muestras que se tienen que analizar usando protocolos de enriquecimiento -detección de microorganismos. ANTECEDENTES

Los fabricantes y las respectivas agencias reguladoras se esfuerzan por mejorar continuamente la seguridad y la calidad de alimentos, productos farmacéuticos, productos nutracéuticos, agua y el medio ambiente. Bajo recientes directrices y pautas del Departamento de Agricultura de los EE.UU., Servicio de Inspección y Seguridad de los Alimentos (FSIS), muchos productores de alimentos en los Estados Unidos han adoptado planes de muestreo que implican el ensayo, por ejemplo, en recortes de vacuno crudo y/o carne picada de E. coli O157: H7 y en los productos listos para comer de Listeria monocytogenes y/o Salmonella. Se observan tendencias similares en otros países, para productos retenidos para consumo doméstico y/o exportación. Por ejemplo, la industria farmacéutica gasta considerables recursos en ensayo de esterilidad y seguimiento medioambiental y la industria del agua y de las aguas residuales y sus respectivas agencias reguladoras destinan considerables recursos a seguir la calidad del agua (por ej., bebida, fuentes recreativas y de la industria pesquera), aguas residuales (tratadas y no tratadas) y lodo (biosólidos). La preocupación por la calidad del aire ha dado como resultado, el control en el aire interior de la presencia de contaminantes microbianos y patógenos. Estos planes de muestreo asociados con dicho ensayo determinan, por ejemplo, la disposición de productos y los lotes de producción o dan como resultado decisiones que consideran la seguridad del agua, que acogen aguas y aguas recreativas y el impacto del vertido de agua residual y la calidad del aire.

La técnica operativa con respecto a dichos esfuerzos por el control de la “retención y liberación” del producto comprende diversos planes diferentes de muestreo, siguiendo típicamente pautas de la Comisión Internacional sobre Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos (ICMSF) para ensayo de productos alimenticios, pautas de FDA y USDA o EPA,

o planes de muestreo intuitivos. La característica común de estos planes de muestreo es que se combinan diversas muestras que representan lotes de producción o una serie de muestras medioambientales, en un lote de producción combinado previamente al muestreo. Por ejemplo, un plan típico para detección de patógenos microbianos requiere tomar más de una muestra, por ejemplo diez (10) a sesenta (60) trozos de muestra de un lote de muestras dado (lote de producción combinado), para formar una muestra de material compuesto para ensayo. Véase, por ejemplo, ROHCF et al:”optimising composite sampling protocols”, Env. sci.& tech. 30.2899. El número de trozos tomados para formar la muestra de material compuesto depende, bajo ICMSF u otras pautas reguladoras, del resultado de la infección/envenenamiento (por ej., la importancia), el nivel de peligro y el aumento potencial en los niveles de peligro debido a almacenamiento. Lo mismo es válido en la detección de constituyentes microbianos y/u organismos de la alteración. Con respecto a ensayo de E. coli 0157, por ejemplo, un plan típico requiere tomar 60 muestras (por ej., trozos de muestra) de un lote de producción para formar una sola muestra de material compuesto. Con respecto a Listeria monocytogenes, típicamente se toman treinta (30) muestras de un lote de producción para formar una muestra de material compuesto. Con respecto a ensayo de esterilidad, un plan típico puede requerir para la composición 10-100 unidades del producto y en el caso de muestreo medioambiental, con frecuencia se forma el material compuesto con 2-10 muestras. Generalmente, el número de muestras que componen el material compuesto refleja: la sensibilidad global del procedimiento de ensayo y el límite de detección que se aplica a la unidad de ensayo; la capacidad para concentrar/enriquecer la muestra de material compuesto para conseguir la sensibilidad deseada y el coste de muestreo en comparación con el coste de análisis.

Los costes asociados al ensayo de alimentos son sustanciales y por consiguiente los productores con frecuencia recurren a aumentar el tamaño del “lote de producción” que se tiene que ensayar. Por ejemplo, el lote de producción de tamaño estándar en ensayo en recortes de E. coli 0157 en la industria de vacuno de los EE.UU. es cinco (5) “combinaciones” (pesando cada combinación aproximadamente 907 kg (2.000 libras)) y de Listeria y Salmonella en productos listos para comer (LPC), es una muestra de material compuesto por línea de producción por turno. Un problema principal asociado al uso de lotes de ensayo de gran tamaño es que una gran cantidad de productos se debe degradar o destruir en el caso de que haya una determinación positiva de un patógeno. Adicionalmente, debido a la naturaleza de combinación “repartición por lotes” (combinación, para fines de formación del lote de ensayo, varios sublotes independientes que se extienden colectivamente por un largo periodo de tiempo de producción), es muy difícil investigar la causa del incumplimiento y la localización de la fuente/causa y no se pueden tomar eficazmente medidas de recuperación. Además, formar materiales compuestos de un gran número de muestras puede dar como resultado una sensibilidad reducida para la unidad de ensayo y efectuar desfavorablemente el límite de detección.

Típicamente, una vez que se construye una muestra de material compuesto (siguiendo la técnica con respecto a ensayo particular) se enriquece después por la presencia de un patógeno/microbio dado por adición de cantidades apropiadas de medios de enriquecimiento e incubación a una temperatura apropiada durante una cantidad de tiempo dada. Si está presente el patógeno/microbio, entonces crece y se multiplica en las condiciones favorables de enriquecimiento, proporcionando de ese modo más material que se puede detectar por análisis posteriores. Después se ensaya la muestra de material compuesto por uno o más procedimientos reconocidos en la técnica, disponibles, incluyendo, por ejemplo, enriquecimiento seguido por ensayos basados en inmunoanálisis o procedimientos basados en la PCR o cultivo del organismo de interés u otros procedimientos basados en ADN o inmunoquímicos.

La técnica anterior descrita ya presenta diversas deficiencias sustanciales. Primero, incluso aunque el lote de producción de la técnica anterior incluye diversos sublotes de producción (por ejemplo, 5 combinaciones/palés de productos o un turno completo de producción), si se obtiene una determinación positiva para el lote de producción (muestra de ensayo de material compuesto), se rechaza el lote completo de producción (las 5 combinaciones/palés o un turno de producción) y se desvía a usos finales económicamente no deseables (por ej., cocina o desecho), incluso aunque el patógeno de interés pueda ser confinado a sólo una porción limitada de los sublotes de producción (correspondiendo a una o dos combinaciones/palés o una hora de producción) que comprende el lote de producción.

Segundo, la técnica actual no permite volver a ensayar cualquier sublote de producción, principalmente debido a que los contaminantes microbianos se propagan desigualmente por los productos y en muchos casos los niveles de contaminación son mínimos y pueden estar presentes en porciones muy pequeñas de los productos en cada sublote. Por lo tanto, una vez que se construye una muestra de material compuesto si su ensayo da positivo se destruyen todos los sublotes. Las agencias de regulación no permiten volver a ensayar...

1. Procedimiento de muestreo, ensayo y validación de lotes de ensayo, que comprende: a) recoger una pluralidad de porciones de cada uno de una pluralidad de lotes de ensayo, comprendiendo cada uno de los lotes de ensayo una unión de una o más muestras, en la que de cada lote de ensayo se toman muestras por separado tomando dicha pluralidad de porciones de los mismos; b) combinar las porciones recogidas correspondientes a cada uno de los lotes de ensayo separados para proporcionar una serie correspondiente de muestras de lotes de ensayo separadas, en la que cada muestra de lotes de ensayo separada se atribuye a un correspondiente lote de ensayo separado, particular; c) incubar la serie de muestras de lotes de ensayo separadas en condiciones adecuadas para permitir niveles de un agente u organismo objetivo que esté presente en una o más de las muestras de lotes de ensayo separadas para alcanzar niveles detectables y llegar a ser uniformes o sustancialmente uniformes, por la respectiva o respectivas muestras de lotes de ensayo separadas, para proporcionar una serie de muestras de lotes de ensayo enriquecidas separadas; d) retirar, asépticamente, porciones iguales de cada muestra de lotes de ensayo separada enriquecida y combinar las porciones retiradas para proporcionar una muestra de material compuesto modular y e) ensayar la muestra de material compuesto modular, usando un ensayo de detección adecuado, para el agente u organismo objetivo, en el que en el caso de que tal ensayo sea negativo se validan todas las muestras de lotes de ensayo separadas y en el que en el caso de que dicho ensayo sea positivo se pueden validar aún sin embargo los lotes de ensayo individuales por ensayo adicional de una porción de la respectiva muestra de lotes de ensayo separada, enriquecida, usando el mismo protocolo o uno más sensible y obtener un resultado de ensayo negativo.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además, formar una muestra de material compuesto modular adicional a partir de las muestras de lotes de ensayo enriquecidas de c) y ensayar la muestra de material compuesto modular adicional, usando el mismo ensayo o un ensayo adecuado diferente, para confirmar el estado del ensayo.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además, formar una muestra de material compuesto modular adicional de una muestra de lotes de ensayo enriquecida adicional junto con cualquier muestra de lotes de ensayo enriquecida de c) que da ensayo negativo en e) y ensayar la muestra de material compuesto modular adicional, usando

el mismo ensayo o un ensayo adecuado diferente.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además, en el caso de que el ensayo de la muestra de material compuesto modular en e) sea negativo, formar una muestra de material compuesto modular adicional a partir de las muestras de lotes de ensayo enriquecidas de c) y ensayar la muestra de material compuesto modular adicional, usando un ensayo adecuado diferente, para confirmar el estado de ensayo negativo.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además, en el caso de que el ensayo de la muestra de material compuesto modular sea positivo, determinar qué lotes de ensayo individuales son positivos y aplicación de medidas de recuperación que sean específicas de uno o más lotes de ensayo individuales que den un ensayo positivo.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el lote de ensayo se selecciona del grupo que consiste en un lote medioambiental que comprende una

o más muestras medioambientales unidas operacionalmente, lote farmacéutico que comprende una o más muestras farmacéuticas unidas operacionalmente, lote de producto de una sola unidad que comprende una o más muestras de producto unidas operacionalmente y combinaciones de los mismos.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el lote de ensayo es un lote de producción de una sola unidad constituido por muestras de producto unidas operacionalmente.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que las muestras de producto son sinónimas de porciones de producto.

9. El procedimiento según cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, que comprende además incubar la muestra de material compuesto modular de d), previamente al ensayo en e).

10. El procedimiento según cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que incubar cada muestra de lotes de ensayo en c) comprende añadir una cantidad de medio de enriquecimiento a la muestra y en el que retirar en d) comprende retirar una porción del medio de enriquecimiento de cada una de las muestras enriquecidas y combinar las porciones retiradas para proporcionar una muestra de material compuesto modular.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que ensayar la muestra de material compuesto modular, usando un ensayo de detección adecuado comprende usar una etapa de concentración para concentrar el agente u organismo microbiano.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en el caso de que el ensayo en e) de la muestra de material compuesto modular sea positivo y en el

que los lotes de ensayo individuales se ensayan además, tal ensayo adicional comprende el uso del protocolo más sensible.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el protocolo más sensible comprende el uso de una etapa de concentración para concentrar el agente u organismo

5 microbiano, junto con el mismo protocolo de ensayo usado para ensayar la muestra de material compuesto modular.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que lote de ensayo se selecciona del grupo de lotes que consiste en una sola combinación, un solo bote, un solo palé y un segmento de producción.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el numero de lotes de ensayo es de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, aproximadamente 5 a aproximadamente 8 o aproximadamente 5.

16. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que, en a) recoger una pluralidad de porciones de cada uno de una pluralidad de lotes de ensayo comprende recoger por separado 15 de cada lote de ensayo una serie de porciones seleccionadas del grupo que consiste en de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 y de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 porciones, de preferencia aproximadamente 30 a aproximadamente 60 porciones, más de preferencia aproximadamente 30 porciones o aproximadamente 60 porciones.