LOS VIRUS RESPIRATORIOS SINCITIALES ATENUADOS (RSV) Y LAS COMPOSICIONES DE VACUNAS DE LOS MISMOS SE PRODUCEN INTRODUCIENDO MUTACIONES ESPECIFICAS ASOCIADAS A FENOTIPOS DE ATENUACION EN EL TIPO SALVAJE O RSV COMPLETAMENTE ATENUADO A TRAVES DE UN PASO FRIO O DE LA INTRODUCCION DE MUTACIONES QUE PRODUCEN VIRUS QUE TIENEN UN FENOTIPO SENSIBLE A LA TEMPERATURA (TS) O ADAPTADO AL FRIO (CA).

ALTERNATIVAMENTE, LOS RSV RECOMBINANTES Y LAS COMPOSICIONES DE VACUNAS DE LOS MISMOS INCORPORAN CARACTERISTICAS DE ATENUACION Y OTRAS ESTRUCTURALES DESEADAS DE ESPECIFICACION DE LAS MUTACIONES Y/O FENOTIPICAS EN UN RSV RECOMBINANTE. LOS RSV RECOMBINANTES INCORPORAN MUTACIONES DESEADAS ESPECIFICADAS POR UNA INSERCION, DELECION, SUSTITUCION O REDISPOSICION DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SELECCIONADOS, GEN O SEGMENTO GENICO EN UN CLON DE RSV INFECCIOSO. SE ESTIMULA EL SISTEMA INMUNE DE UN INDIVIDUO PARA INDUCIR UNA PROTECCION CONTRA UNA INFECCION PROVOCADA POR UN RSV NATURAL, O DE FORMA MULTIVALENTE, CONTRA UNAINFECCION PROVOCADA POR UN RSV Y OTRO PATOGENO, TAL COMO PIV, MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE UN RSV ATENUADO DERIVADO BIOLOGICAMENTE O RECOMBINANTE

Producción de vacunas a base de virus respiratorio sincitial atenuado, a partir de secuencias nucleotídicas clonadas.

Orígenes de la invención

El virus respiratorio sincitial (RSV) supera a cualquier otro patógeno microbiano como causa de la neumonía y bronquiolitis en bebés menores de un año de edad. Prácticamente todos los niños se infectan antes de los dos años de edad, y la reinfección se produce con frecuencia apreciable en niños más mayores y adultos jóvenes (Chanock et al., en Viral Infections of Humans,. 3 ª ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, NY (1989)). El RSV es responsable de más de uno de cada cinco ingresos hospitalarios pediátricos debido a las enfermedades de las vías respiratorias y, sólo en Estados Unidos, es la causa de aproximadamente unas 91.000 hospitalizaciones y de 4.500 muertes al año. Aunque la mayoría de los adultos sanos no tienen una enfermedad grave debido a la infección por RSV, los pacientes ancianos y los pacientes inmunodeficientes sufren a menudo infecciones graves que incluso a veces pueden provocar la muerte por este patógeno.

A pesar de décadas de investigación para desarrollar agentes vacunales eficaces contra el RSV, aún no se ha conseguido una vacuna segura y eficaz para prevenir la morbilidad grave y la mortalidad significativa asociada a la infección por el RSV. La falta de desarrollo de vacunas eficaces tiene que ver en parte al hecho de que los bebés han disminuido las respuestas de anticuerpos secretores y serosos a antígenos del RSV. Por esa razón, estas personas sufren infecciones más graves del RSV, mientras que la inmunidad acumulada parece proteger a los niños más mayores y a adultos contra los ataques más graves del virus. Un compuesto antiviral, la ribavarina, da esperanzas en el tratamiento de niños gravemente infectados, aunque no hay indicaciones de que acorte la duración de la hospitalización o que disminuya la necesidad de que el niño reciba un tratamiento complementario.

Recientemente, los mecanismos de inmunidad en la infección por RSV han sido el centro de atención. Los anticuerpos secretores parecen ser más importantes en la protección del tracto respiratorio superior, mientras que se considera que los altos niveles de anticuerpos de suero tienen un papel principal en la resistencia a la infección por el RSV en el tracto respiratorio inferior. La inmunoglobulina humana purificada que contiene un alto título de anticuerpos neutralizantes contra el RSV puede resultar útil en algunos casos de tratamientos inmunoterapéuticos de enfermedades graves del tracto respiratorio inferior en los bebés y niños pequeños. Sin embargo, las preparaciones de inmunoglobulina, tienen varias desventajas, tales como la posibilidad de transmitir un virus de transmisión sanguínea y la dificultad y el gasto en su preparación y en el almacenamiento.

La Formalina, vacuna del virus inactivado, se probó en la década de mediados de los sesenta, pero falló en la protección contra la o enfermedad o infección por el RSV y, de hecho, exacerbó los síntomas durante la infección posterior por el virus. (Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89:422-434 (1969), Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421 (1969)).

Más recientemente, el desarrollo de una vacuna para el RSV se ha centrado en los mutantes del RSV atenuados. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968) informaron sobre un mutante de paso a frío del RSV (cpRSV), que parecía ser lo suficientemente atenuado ser una vacuna experimental. Este mutante mostró una ligera eficiencia incrementada de crecimiento a 26ºC en comparación con su virus parental silvestre, pero su replicación no era ni sensible a la temperatura ni adaptada de manera significativa al frío. Sin embargo, el mutante de paso a frío se atenuaba para los adultos. Aunque se atenuaba de manera satisfactoria e inmunógena para bebés y niños que habían sido previamente infectados con el RSV (es decir, individuos seropositivos), el mutante cpRSV retuvo una virulencia de bajo nivel para el tracto respiratorio superior de los bebés seronegativos.

Del mismo modo, Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969) informó sobre el aislamiento de los mutantes del RSV (tsRSV) sensibles a la temperatura que eran también candidatos vacunales. Un mutante, ts-1, se evaluó extensamente en el laboratorio y en voluntarios. El mutante produjo la infección asintomática en adultos voluntarios y confirió resistencia al ataque con virus silvestres 45 días después de la inmunización. Una vez más, mientras que los bebés y los niños seropositivos fueron sometidos a una infección asintomática, los bebés y los niños seronegativos desarrollaron signos de rinitis y otros síntomas leves. Además, se detectó la inestabilidad del fenotipo ts, aunque el virus que mostraba una pérdida parcial o completa de la sensibilidad a la temperatura representaba una pequeña proporción del virus recuperable de las vacunaciones y no se asoció con signos de enfermedad distinta a la rinitis leve.

Estos y otros estudios revelaron que determinadas cepas de RSV sensibles a la temperaturas y al paso al frío fueron infraatenuados y provocaron síntomas leves de la enfermedad en algunas personas vacunadas, particularmente en bebés seronegativos, mientras que otros fueron sobreatenuados y no se reprodujeron lo suficiente como para provocar una respuesta inmune protectora, (Wright et al. Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Además, la inestabilidad genética de los mutantes de la vacuna experimental se tradujo en la pérdida de su fenotipo sensible a la temperatura, además de obstaculizar el desarrollo de vacunas eficaces contra el RSV. Véase, en general, Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), y Belshe et al., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978).

Al abandonar el enfoque de la vacuna del virus RS atenuado, los investigadores probaron los potenciales candidatos de la vacuna de la subunidad utilizando glicoproteínas de la envoltura del virus RS purificado de lisados de células infectadas. Las glicoproteínas indujeron resistencia a la infección del virus RS en los pulmones de ratas algodoneras, Walsh et al., J. Infect. Dis. 155:1198-1204 (1987), pero los anticuerpos tenían una actividad neutralizadora muy débil y la inmunización de los roedores con la vacuna de la subunidad purificada condujo a la potenciación de la enfermedad (Murphy et al. Vaccine 8:497-502 (1990)).

También se han explorado las vacunas basadas en los recombinantes vacunales del virus que expresan la glicoproteína de cobertura F o G. Estos recombinantes expresan glicoproteínas del RSV que son indistinguibles del homólogo viral auténtico, y los pequeños roedores infectados por vía intradérmica con los virus recombinantes F y G del RSV vacunal desarrollaron altos niveles de anticuerpos específicos que neutralizan la infectividad vírica. De hecho, la infección de las ratas algodoneras con los recombinantes vacunales F estimularon casi la resistencia completa a la replicación del RSV en el tracto respiratorio inferior y una resistencia significativa en el tracto superior, Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83:7462-7466 (1986). Sin embargo, la inmunización de los chimpancés con el recombinante vacunal F y el recombinante vacunal G casi no proporcionaba protección contra el ataque del RSV en el tracto respiratorio superior (Collins et al. Vaccine 8:164-168 (1990)) y una protección inconsistente en el tracto respiratorio inferior (Crowe et al. Vaccine 11:1395-1404 (1993).

Las promesas incumplidas de cepas del RSV atenuado, las vacunas de subunidades y otras estrategias para desarrollo de la vacuna del RSVsubraya la necesidad de nuevos métodos para identificar objetivos genéticos para la ingeniería recombinante de nuevas vacunas contra el RSV y desarrollar métodos para manipular el RSV recombinante para incorporar cambios genéticos con el fin de dar nuevas propiedades fenotípicas en recombinantes viables y atenuados de RSV. Sin embargo, la manipulación del RNA genómico del RSV y otros virus del RNA de sentido negativo han demostrado ser difíciles. Los principales obstáculos en este sentido incluyen la no infectividad del RNA genómico desnudo de estos virus, el pobre crecimiento viral en el cultivo tisular, los largos ciclos de replicación, la inestabilidad de los viriones, un genoma complejo y...

1. Se proporciona una partícula del RSV infeccioso que se atenúa en el tracto respiratorio de un hospedador el cual incluye un genoma o antigenoma del RSV recombinante, una proteína (N) de la nucleocápside principal, una fosfoproteína de la nucleocápside (P), una proteína polimerasa grande (L) y un factor de elongación de la RNA polimerasa, en donde el antigenoma o el genoma recombinante se modifica para ablacionar o disminuir la expresión de un gen SH, NS1, NS2 o G, mediante la deleción del gen o introduciendo un codón de terminación en el gen ORF.

2. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación anterior, en donde el genoma o el antigenoma del RSV recombinante incluye además un gen o segmento de gen que codifica una región de la proteína F o G inmunogénica, en donde la región de la proteína F o G inmunogénica es de un subgrupo del RSV diferente del subgrupo del RSV genómico o antigenómico.

3. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior, en donde el RSV recombinante genómico o antigenómico incluye una quimera de una secuencia del RSV humano y, al menos, una secuencia del RSV no humano.

4. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior, en donde RSV genómico o antigenómico codifica un RSV humano donde, además, un gen seleccionado o un segmento del gen es sustituido con un gen homólogo o un segmento de gen de un RSV heterólogo.

5. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 4, en donde el gen seleccionado es NS1 o NS2 y el gen homólogo es N.

6. Una partícula del RSV infeccioso de acuerdo con cualquier reivindicación de la 1 a la 3, en donde el genoma o antigenoma del RSV recombinante incluye además un gen o segmento de gen a partir del PIV que sustituye un gen homólogo o segmento de gen del RSV.

7. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 6, en donde el gen PIV o segmento del gen codifica HN o la glicoproteína F de PIV1, PIV2, o PIV3.

8. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 1, en donde el genoma o el antigenoma del RSV incluye además un polinucleótido que codifica uno o más puntos de restricción insertados en un punto intergénico del genoma o antigenoma del RSV.

9. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 8, en donde el polinucleótido que codificada uno o más puntos de restricción se inserta entre los nucleótidos 5611 y 5616 del antigenoma o genoma del RSV.

10. Una partícula del RSV infeccioso según la reivindicación 1, en donde el genoma o el antigenoma del RSV recombinante incluye además una secuencia de nucleótidos de una molécula que no sea del RSV seleccionado a partir de una citoquina, un epítopo colaborador T, un marcador del punto de restricción o una proteína del patógeno microbiano capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

11. Una partícula del RSV infeccioso según cualquier reivindicación anterior que sea una partícula subviral.

12. Uso de la partícula infecciosa del RSV de cualquier reivindicación anterior en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por RSV.

13. Uso según la reivindicación 12, en donde dicho medicamento se formula para administrarse en una dosis de 10³ a 10⁶ PFU de la partícula del RSV infeccioso.

14. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación 12 o 13, en donde el medicamento se formula para administrase en el tracto respiratorio superior.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14 en donde el medicamento se formula para administrarse por medio de nebulizador, gotas o aerosol.

16. Una vacuna para inducir la protección contra el RSV, que incluye una cantidad inmunológicamente suficiente de la partícula del RSV infeccioso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un portador fisiológicamente aceptable.

17. Una vacuna según la reivindicación 16, formulada en una dosis de 10³ a 10⁶ PFU de la partícula del RSV infeccioso.

18. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones de 16 o 17, formulada para la administración en el tracto respiratorio superior por nebulizador, gotas o aerosol.