Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende:

a) inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer. donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia

A lo largo de esta solicitud se mencionan diversas referencias usando citas abreviadas entre paréntesis. Citas completas para estas referencias se pueden encontrar al final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a métodos para normalizar la medida de la actividad de acetato de glatiramer basada en el reconocimiento específico del acetato de glatiramer por células T.

ANTECEDENTES

Es deseable normalizar la medida de la actividad de composiciones farmacéuticas porque hay una actividad y calidad óptimas de componente activo que es eficaz al tratar la enfermedad para la que se administra.

El acetato de glatiramer (GA, conocido también como Copolymer-1 (Guía de Referencia Médica), Copolymer 1, Cop-1 o COPAXONE¡) es un fármaco autorizado para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS). El acetato de glatiramer consiste en sales acetato de polipéptidos sintéticos que contienen cuatro aminoácidos naturales (Guía de Referencia Médica): ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina, y L-lisina (Guía de Referencia Médica) con una fracción molar media de ácido L-glutámico: 0,129-153; L-alanina: 0,392-0,462; L-tirosina: 0,086-0,100; L-lisina: 0,300-0,374, respectivamente. El peso molecular medio del acetato de glatiramer es 4.700-11.000 daltons (Guía de Referencia Médica). Químicamente, el acetato de glatiramer se denomina acetato (sal) de polímero de ácido L-glutámico con L-alanina, L-lisina y L-tirosina (Guía de Referencia Médica). Su fórmula estructural es:

(Glu, Ala, Lys, Tyr)x∇xCH3COOH (C5H9NO4∇C3H7NO2∇C6H14N2O2∇C9H11NO3)X∇xC2H4O2

CAS – 147245-92-9 (Guía de Referencia Médica). El acetato de glatiramer se escribe también como sigue:

poli(L-Glu13-15, L-Ala39-46, L-Tyr8,6-10, L-Lys30-37)∇nCH3COOH.

Se demostró que el acetato de glatiramer elimina la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) – un modelo experimental para la esclerosis múltiple (MS) en diversas especies animales (Lando et al., 1979; Aharoni, 1993). Estudios de EAE en roedores murinos sugirieron que la protección frente a la EAE está mediada por la actividad de las células T (Aharoni, 1993). Esta protección frente a la inducción activa de EAE por homogeneizado de médula espinal de ratón, en la que están implicados varios autoantígenos, se pudo transferir adoptivamente a receptores normales por inyección de células T supresoras específicas de acetato de glatiramer (Aharoni, 1993). En ensayos clínicos de fase III se descubrió que inyecciones diarias subcutáneas de acetato de glatiramer retardan el avance del problema y reducen la frecuencia de recidivas en el agravamiento-remisión de la esclerosis múltiple (Johnson, 1987). Procedimientos de fabricación de acetato de glatiramer se describen en las Patentes de U.S. Nos. 3.849.550 y 5.800.808. y en la Publicación Internacional PCT No. WO 00/05250.

Se acepta normalmente que un alto nivel de especificidad antigénica es una característica de la activación de células T. Las células T del sistema inmune reconocen péptidos inmunológicos complejados con moléculas de clase I o II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), expresadas en células presentadoras de antígenos (APCs). La especificidad del reconocimiento de antígenos por células T se define por varios parámetros: 1) afinidad del receptor de células T por el complejo peptídico MHC; 2) secuencia primaria del péptido antigénico; y 3) efectos sinérgicos de ciertas combinaciones de aminoácidos en el péptido antigénico. Sobre la base del conocimiento actual del mecanismo de acción del acetato de glatiramer, se cree que la actividad biológica del acetato de glatiramer en la MS está mediada por inmunomodulación de la actividad de células T.

SUMARIO DE LA INVENCION

La invención derivada de contrato de financiación proporciona un procedimiento para medir la actividad de un lote de pruebas de acetato de glatiramer respecto a la conocida actividad de un lote de referencia de acetato de glatiramer que comprende

a. inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia;

b. preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de inmunizar;

c. incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia;

d. incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba;

e. determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 1821 horas de incubación de tal muestra;

f. correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer,

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

La invención derivada de contrato de financiación proporciona también un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia de acetato de glatiramer que comprende

a. inmunizar un mamífero de prueba con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia;

b. preparar un cultivo primario de células del mamífero de prueba de la etapa

(a) en un momento predeterminado después de inmunizar;

c. incubar separadamente al menos dos muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer de un lote de referencia;

d. incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba;

e. determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de una citoquina segregada por las células de cada muestra después de un periodo de tiempo predeterminado de incubación de tal muestra;

f. correlacionar las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del

lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia

de acetato de glatiramer, donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra de inmunización que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Inmunización con GA RS (Patrón de Referencia). Cultivo primario de células LN (de Nódulos Linfáticos). Detección de IL-2 por ELISA.

Figura 2: Inducción de células T específicas de GA. Cultivos primarios de células LN derivadas de ratones inmunizados con 250 µgdeGARS+CFA oconCFA solamente, se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de GA RS. Tras incubación durante una noche a 37ºC, se recogieron los medios de cultivo y se analizaron por ELISA para la IL-2.

Figura 3: Diagrama de hemocitómetro.

Figura 4: Optimización del protocolo de inmunización – efecto de la fuente de cultivo y de la dosis del Patrón...

1. Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende: a) inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer.

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde seis muestras de referencia se incuban separadamente en la etapa (d).

3. Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende: a) inmunizar un mamífero de prueba con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células del mamífero de prueba de la etapa (a) en un tiempo predeterminado después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos dos muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células de un cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de citoquina segregada por las células en cada muestra tras un periodo de tiempo predeterminado de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer.

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra de incubación que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, donde la citoquina es una interleuquina.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-2.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-6.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-10.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, donde la citoquina es interferón-gamma.

9. El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero produce células T específicas del patrón de referencia de acetato de glatiramer.

10. El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero es un roedor.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde el roedor es un ratón.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, donde el ratón es un ratón hembra (SJLXBALB/C)F1.

13. El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero es de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 semanas de edad.

14. El procedimiento de la reivindicación 3, donde las células son células de nódulos linfáticos.

15. El procedimiento de la reivindicación 3, donde las células son células del bazo.

16. Un procedimiento para preparar un lote de acetato de glatiramer como aceptable

para uso farmacéutico que comprende:

a) preparar un lote de acetato de glatiramer;

b) medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de

la reivindicación 1; y

c) calificar el lote como aceptable para uso farmacéutico si la actividad relativa así medida es entre 80% y 125% del lote de referencia de acetato de glatiramer.

17. Un procedimiento para preparar acetato de glatiramer aceptable para uso

farmacéutico que comprende:

a) preparar un lote de acetato de glatiramer;

b) medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de

una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15; y

c) calificar el lote como aceptable para uso farmacéutico si la actividad relativa así medida es entre 80% y 125% del lote de referencia de acetato de glatiramer.

18. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que contiene acetato de glatiramer que comprende: obtener un lote de acetato de glatiramer a probar; medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer. a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada del lote patrón de referencia, y b) cuando una muestra que contiene el prácticamente idéntico número de células predeterminado se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así para determinar la actividad de un lote de acetato de glatiramer que está siendo probado; e incluir en la composición farmacéutica un lote solamente si su potencia así medida es entre 80% y 125% del lote patrón de referencia.

19. Un procedimiento para determinar la actividad de un lote de acetato de glatiramer que comprende: medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer, a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada de lote patrón de referencia; y

b) cuando una muestra que contiene el número predeterminado prácticamente idéntico de células se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así,

determinado con ello la actividad del lote.

20. Un procedimiento para determinar si un lote de acetato de glatiramer tiene una actividad predeterminada aceptable para inclusión en una composición farmacéutica que comprende: medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer, a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada del lote patrón de referencia, y b) cuando una muestra que contiene el número predeterminado prácticamente idéntico de células se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así para determinar la actividad del lote; y comparar la actividad así medida con una actividad predeterminada para determinar si el lote es aceptable para incluirlo en la composición farmacéutica.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 20, donde el lote patrón de referencia es un lote de acetato de glatiramer que tiene un peso molecular medio de 7000 Da.

22. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que contiene acetato de glatiramer que comprende obtener un lote de acetato de glatiramer; y medir la actividad del lote de acetato de glatiramer en relación con la actividad de un patrón de referencia de acetato de glatiramer: a) preparando un cultivo primario de células T de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad inmunizados con una cantidad predeterminada del patrón de referencia;

b) incubando por separado muestras de referencia, conteniendo cada una de las cuales un número predeterminado de células del cultivo

primario de la etapa (a) y una cantidad predeterminada del patrón de referencia entre 1 µg/ml y 25 µg/ml;

c) incubando al menos dos muestras, conteniendo cada una de las cuales un número predeterminado de células del cultivo primario de 5 la etapa (a) y una cantidad predeterminada del lote de acetato de

glatiramer;

d) determinando para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células T en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; y

10 e) correlacionando las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el patrón de referencia para determinar la actividad del lote de acetato de glatiramer en relación con la patrón de

15 referencia, donde en cada muestra de las etapas (b) y (c) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica del patrón de referencia; y preparando la composición farmacéutica usando el lote de acetato de glatiramer si su actividad relativa así medida es entre 80% y 125% de la actividad del patrón de referencia.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde las 25 células son células de nódulos linfáticos.

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde las células son células del bazo.