Procedimientos analíticos por electroforesis capilar quiral para la separación rápida de los enantiómeros del aminoácido no proteico ornitina y su determinación en alimentos.

La invención consiste en el desarrollo de dos procedimientos en condiciones de análisis diferentes: condiciones básicas utilizando tampón borato conteniendo una ciclodextrina (CD) neutra como selector quiral y (ii) condiciones ácidas empleando tampón fosfato conteniendo un sistema dual de CDs (neutra y aniónica) como selectores quirales. Estos procedimientos analíticos permiten la determinación de la forma L y D de ornitina (Orn) en muestras alimentarías.

Suponen un gran avance porque son los primeros procedimientos en condiciones totalmente distintas que se han desarrollado empleando la técnica de separación de Electroforesis Capilar (CE) para el análisis quiral de Orn en el campo de los alimentos en unos tiempos de separación considerablemente inferiores a los utilizados por otras técnicas de separación. Además, son procedimientos complementarios que permiten contrastar los resultados obtenidos para muestras alimentarías, lo cual es de un gran interés para muestras complejas

Procedimientos analíticos por electroforesis capilar quiral para la separación rápida de los enantiómeros del aminoácido no proteico ornitina y su determinación en alimentos.

La invención consiste en el desarrollo de dos procedimientos en condiciones de análisis diferentes: condiciones básicas utilizando tampón borato conteniendo una ciclodextrina (CD) neutra como selector quiral y (ii) condiciones ácidas empleando tampón fosfato conteniendo un sistema dual de CDs (neutra y aniónica) como selectores quirales. Estos procedimientos analíticos permiten la determinación de la forma L y D de ornitina (Orn) en muestras alimentarias. Suponen un gran avance porque son los primeros procedimientos en condiciones totalmente distintas que se han desarrollado empleando la técnica de separación de Electroforesis Capilar (CE) para el análisis quiral de Orn en el campo de los alimentos en unos tiempos de separación considerablemente inferiores a los utilizados por otras técnicas de separación. Además, son procedimientos complementarios que permiten contrastar los resultados obtenidos para muestras alimentarias, lo cual es de un gran interés para muestras complejas.

Estado de la técnica

La determinación del contenido de aminoácidos en alimentos es necesaria por consideraciones de seguridad y calidad nutricional y por los requerimientos en la fabricación de alimentos, por ejemplo, para evaluar productos alimentarios nuevos, para controlar los niveles de enriquecimiento y para identificar o caracterizar productos, su procesado y características organolépticas [1]. La Orn es un aminoácido no proteico quiral y aunque hasta el momento no se conocen estudios de la toxicidad del enantiómero D de este aminoácido, la especificidad de la maquinaria celular conlleva a que no se metabolice por nuestro organismo de la misma forma que el enantiómero L. Además, es importante tener en cuenta que los D-aminoácidos pueden estar presentes en alimentos como consecuencia de someterlos a tratamientos como la tostación, fermentación, pasteurización, etc., por la adición de mezclas racémicas durante la fabricación, por la producción de estos D-aminoácidos por microorganismos, o por la presencia de la forma D por contaminación microbiana ya que los microorganismos contienen D-aminoácidos en la pared bacteriana [2-4].

Aunque la determinación de Orn en alimentos se ha realizado en condiciones aquirales empleando técnicas de separación como HPLC [5-12], GC [13-16] y CE [17-19], la determinación enantioselectiva de Orn, en presencia de otros aminoácidos proteicos, en muestras alimentarias sólo se ha llevado a cabo hasta la fecha por HPLC [20] y GC [20-23].

Por HPLC, se realizó una derivatización con o-ftaldialdehído (OPA) junto con tioles quirales para formar derivados tipo isoindol diastereoméricos que se separan en una columna aquiral. La separación de los derivados de Orn se consiguió en 70 minutos. Con este método se analizaron distintas cervezas con distinto grado de fermentación [20] y zumos de vegetales y frutas [21].

Por GC, los diferentes enantiómeros de los aminoácidos se convirtieron en sus respectivos ésteres y se resolvieron en columnas quirales. La separación de los ésteres de Orn se alcanzó en unos 35 min. La determinación de Orn se ha realizado en cervezas [20], en zumos de vegetales y frutas [21], en queso emmental y habas negras fermentadas [22] y mieles tratadas térmicamente [23].

Por CE sólo hay dos trabajos en la bibliografía en los que se ha conseguido la separación enantiomérica de Orn en presencia de otros seis [24] o siete [25] aminoácidos proteicos. En ambos trabajos se emplearon sistemas micelares, en uno el tensioactivo quiral (S) y (R)-N-dodecoxicarbonilvalina [24] y en otro el tensioactivo no quiral dodecilsulfato sódico en presencia de una CD neutra (?-CD) como selector quiral [25]. Sin embargo, estos métodos por CE no se han aplicado al análisis de alimentos a pesar de necesitar unos tiempos de análisis cortos (13-15 min) para detectar Orn en comparación con HPLC o GC. Por ello, el desarrollo de procedimientos analíticos rápidos y enantioselectivos para determinar Orn empleando CE supone un gran avance metodológico en el análisis de alimentos. Además, el desarrollo de dos procedimientos analíticos por CE totalmente diferentes para la determinación quiral de Orn en alimentos supone una invención de gran relevancia porque permite contrastar resultados en el caso de muestras complejas con un gran número y variedad de aminoácidos proteicos y contribuye al estudio de la seguridad y la calidad de alimentos.

Descripción de la invención

La invención consiste en dos procedimientos analíticos por CE para la determinación quiral de Orn en alimentos destacando las características que se indican en la tabla 1.

Las ventajas principales de los procedimientos de análisis quiral inventados son las siguientes:

Descripción de las figuras

Figura 1. Electroforegrama correspondiente a la separación enantiomérica de Orn en presencia de Lys, Arg y Asp en condiciones básicas. Derivatización previa al capilar (pre-capillary) con FITC. Condiciones electroforéticas: capilar estándar de sílice fundida, 48.5 cm (40 cm hasta la ventana de detección) x 50 µm de diámetro interno; temperatura de separación, 25ºC; voltaje aplicado, + 20 kV; detección UV a 240 nm con un ancho de banda de 10 nm.

Figura 2. Análisis de muestras...

1. Procedimientos analíticos para la determinación de los enantiómeros de Orn que permiten separar y determinar las formas D y L de Orn por electroforesis capilar (CE) en presencia de otros aminoácidos en muestras alimentarias.

2. Procedimientos, según la reivindicación 1, que comprenden una reacción de derivatización previa para alcanzar sensibilidad de detección y permitir la interacción con el selector quiral. Se realiza una derivatización previa (pre-capillary) con FITC, acelerada unas 100 veces con una sonda de ultrasonidos, en condiciones básicas, mientras que se emplea una derivatización en el capilar (in-capillary) con AQC en condiciones ácidas.

3. Procedimientos, según la reivindicación 2, que consisten en el empleo de un medio de separación conteniendo ciclodextrinas (CDs) como selectores quirales: (i) una CD neutra (?-CD 0.13% (p/v)) para el procedimiento en condiciones básicas y (ii) un sistema dual de CDs compuesto por una CD altamente aniónica (ß-CD sulfatada 5% (p/v)) y un derivado de CD neutro (acetil-?-CD 2% (p/v)) para el procedimiento en condiciones ácidas.

4. Procedimientos, según la reivindicación 3, caracterizados porque el tampón de separación se prepara: (i) con una disolución acuosa de borato 100 mM que se ajusta con NaOH a pH 10.0 en condiciones básicas y (ii) con una disolución acuosa de ácido fosfórico 50 mM ajustada con trietanolamina a pH 2.0 en condiciones ácidas.

5. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque la separación electroforética se realiza en capilares estándar de sílice de 50 µm de diámetro interno y 375 µm de diámetro externo. La longitud total y efectiva (desde la inyección hasta la detección) varía según el procedimiento siendo de 48.5 y 40 cm en condiciones básicas y de 72.5 y 64 cm en condiciones ácidas.

6. Procedimientos, según la reivindicación 5, que comprenden un acondicionamiento entre inyecciones con NaOH 0.1 M, H₂O y medio de separación en condiciones básicas y con H₂O, H₃PO₄ 0.1 M y el medio de separación en condiciones ácidas, aplicando una presión de 1 bar durante 2 minutos en cada una de las etapas.

7. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque se llevan a cabo a una temperatura de 25ºC en condiciones básicas y de 15ºC en condiciones ácidas.

8. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque se realizan a un voltaje de separación de +20 kV en condiciones básicas y -25 kV en condiciones ácidas.

9. Procedimientos, según la reivindicación 1, 2, 3 y 4, caracterizados porque la detección se lleva a cabo a una longitud de onda de 240 nm con una anchura de banda de 10 nm en condiciones básicas y una longitud de onda de 260 nm con una anchura de banda de 2 nm en condiciones ácidas.

10. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque tanto patrones como muestras son inyectados en el sistema de CE de forma hidrodinámica (50 mbar durante 5 s).

11. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque permiten determinar los enantiómeros de Orn en alimentos funcionales y alimentos sometidos a procesos de fermentación.