Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada,

uso de un dispositivo micrelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento.

El Procedimiento, sistema y dispositivo reivindicados están basados en la medida de los cambios de impedancia producidos en la interfase de un electrodo al que previamente se han adherido bacterias de una cepa huésped para el bacteriófago que se pretende detectar. Los cambios que se producen en la citada interfase electrodo/bacterias tienen su origen en la actividad fágica de los bacteriófagos sobre las bacterias adheridas en la superficie del electrodo de trabajo de un dispositivo micro-electrónico sensor

Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que está basado en la toma de medidas de impedancia eléctrica del medio o solución analizar, mediante la técnica de espectroscopia de impedancia eléctrica.

También se refiere a un dispositivo micro-electrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento y al uso de dicho dispositivo micro-electrónico sensor para detectar y cuantificar dichos bacteriófagos.

Antecedentes de la invención

Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias, que están formados por ácidos nucleicos (ADN o ARN) envueltos por una cápside proteica. Estos virus presentan una elevada especificad por las bacterias que infectan de manera que se puede detectar un determinado bacteriófago o grupo de bacteriófagos en función de la cepa huésped seleccionada.

De manera resumida, el ciclo de los bacteriófagos consta de 4 fases: en un primer paso se produce el reconocimiento bacteriófago-bacteria y la inyección de los ácidos nucleicos fágicos que contienen la información genética necesaria para la formación de nuevos bacteriófagos. A continuación, el material genético de los bacteriófagos se integra en forma de ADN en el cromosoma bacteriano. Una vez integrado, la infección de la célula huésped puede provocar dos tipos de respuesta en función del tipo de bacteriófago que la infecta. Así, se distinguen los bacteriófagos atemperados, que pueden integrarse en el genoma de la célula huésped indefinidamente o hasta que se induce la lisis por diversos factores, y los bacteriófagos líticos, los cuales tras un periodo de incubación y gracias a la maquinaria biosintética de la célula huésped, replican el material necesario para la creación de nuevos viriones y salen al exterior mediante la lisis de la célula huésped.

La detección y/o cuantificación de bacteriófagos de bacterias entéricas resulta de particular importancia en el control microbiológico de aguas y en la determinación del origen de la contaminación fecal. Dichos bacteriófagos han sido propuestos como microorganismos indicadores de la presencia de virus ya que tienen un comportamiento similar a éstos. Existen tres grupos de bacteriófagos de bacterias entéricas que se emplean como indicadores de contaminación fecal de origen vírico: los colifagos somáticos, fagos RNA F-específicos, y fagos que infectan bacterias Bacteroides spp.

Otro grupo de bacteriófagos cuya detección y/o cuantificación resulta de particular interés, es el formado por los bacteriófagos que infectan bacterias lácticas del tipo de las que se emplean para la producción de quesos u otros productos fermentados de tipo láctico. Dichos bacteriófagos afectan seriamente a la producción de ácido láctico lo que conlleva cuantiosas pérdidas económicas en las industrias lácticas.

Los métodos clásicos para la detección de bacteriófagos se basan en la detección de sus efectos sobre sus bacterias huéspedes. Tradicionalmente para la enumeración de los bacteriófagos se utiliza el ensayo de la doble capa de agar, en el que se deposita una capa de agar semi-sólido que contiene una cepa huésped determinada (en función del bacteriófago que se quiera cuantificar) y la muestra a analizar, sobre una capa de agar. La cuantificación de los bacteriófagos se realiza mediante la detección de zonas o placas de lisis originadas por la infección y lisis de la bacteria huésped por un bacteriófago o grupos de bacteriófagos presentes en la muestra, tras un periodo de incubación de dicha cepa huésped.

Los métodos basados en la siembra en placas presentan el inconveniente de que son muy lentos, puesto que requieren como mínimo 24 de incubación.

Otros métodos más recientemente descritos para la detección de bacteriófagos se basan en la detección de dichos bacteriófagos mediante la técnica PCR. Sin embargo, estos métodos son también lentos y, además, muy laboriosos.

Las patentes europeas EP0149383 y EP0714450 describen otros métodos para detectar bacteriófagos, en concreto para la detección de bacteriófagos de bacterias lácticas.

La patente EP0714450 se refiere a la detección de algún componente interno de la bacteria tras su lisis mediante la emisión de bioluminiscencia, en reacciones enzimáticas catalizadas por enzimas como la luciferaza, mientras que la patente EP0149383, se refiere a la detección de la inhibición del crecimiento mediante el uso de indicadores de pH para detectar la actividad microbiana.

Los métodos descritos en las citadas patentes presentan el inconveniente de que no permiten la detección de los bacteriófagos en estado activo, por lo que resultan en la práctica muy poco fiables. Por otro lado, se trata de métodos muy complejos y caros, puesto que conllevan el uso de un gran número de reactivos.

La solicitud de patente española núm. 200800109, todavía no publicada en el momento de presentar la presente solicitud, se refiere a un procedimiento y dispositivo para medir concentración de biomasa, que emplea la técnica de espectroscopia electroquímica de impedancias (EEI) para determinar el cambio de señal impedimétrica producido por la adhesión de biomasa sobre la superficie del electrodo de trabajo de un dispositivo.

En una realización descrita en la mencionada solicitud de patente, los electrodos con los que se lleva a cabo las medidas de impedancia de la interfase están dispuestos integrados en un sustrato de material de un dispositivo micro-electrónico plano, en concreto un chip sensor, susceptible de ser inmerso en el medio en el que se lleva a cabo la medida de concentración de biomasa de la solución.

En el procedimiento y dispositivo descritos en la citada solicitud de patente, se determina la concentración de biomasa de la solución a partir del valor del cambio de capacitancia de la doble capa eléctrica de la interfase electrodo/solución producido por la adhesión electrostática de biomasa.

La variación de la capacitancia de la doble capa eléctrica de la interfase electrodo/solución se ha visto dependiente de la concentración de biomasa de la solución, por lo que la monitorización de los cambios de capacitancia de dicha capa permite la detección de la concentración de biomasa de la solución, de un modo sencillo y muy fiable, mediante la correspondiente curva de calibración.

Descripción resumida de la invención

Un primer objetivo de la presente invención es el de desarrollar un procedimiento y sistema alternativo para detectar y/o cuantificar bacteriófagos, que está basado en la medida de los cambios de impedancia eléctrica producidos en la interfase de un electrodo al que previamente se le han adherido bacterias.

El procedimiento y sistema descrito presenta la ventaja respecto de los procedimientos del estado de la técnica de que es muy sencillo, económico y altamente fiable.

De acuerdo con este objetivo, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que se caracteriza por el hecho de que comprende las etapas de;

a) adherir bacterias procedentes de por lo menos una de dichas cepas huésped, sobre la superficie de un electrodo de trabajo de un dispositivo que comprende medios para medir impedancia eléctrica,

b) exponer el electrodo procedente de la etapa a) a una solución del material a analizar susceptible de contener bacteriófagos,

c) incubar junto con el electrodo, la solución de la etapa b), en condiciones predeterminadas al objeto de que, si dichas bacterias son infectadas por bacteriófagos, se lleve a cabo la lisis de dichas bacterias adheridas sobre el electrodo,

d) medir el cambio de impedancia eléctrica de dicha solución, mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa c),

e) determinar en el circuito eléctrico equivalente del espectro de impedancias, el valor del cambio de capacitancia de la interfase electrodo-bacterias, a partir de dicho valor de cambio de impedancia,

f) determinar la presencia o la concentración...

1. Procedimiento para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, caracterizado por el hecho de que comprende las etapas de;

a) adherir bacterias procedentes de por lo menos una de dichas cepas huésped, sobre la superficie de un electrodo (2) de trabajo de un dispositivo que comprende medios para medir impedancia eléctrica,

b) exponer el electrodo (2) procedente de la etapa a) a una solución del material a analizar susceptible de contener bacteriófagos,

c) incubar junto con el electrodo (2), la solución de la etapa b), en condiciones predeterminadas al objeto de que, si dichas bacterias son infectadas por bacteriófagos, se lleve a cabo la Tisis de dichas bacterias adheridas sobre el electrodo (2),

d) medir el cambio de impedancia eléctrica de dicha solución, mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa c),

e) determinar en el circuito eléctrico equivalente del espectro de impedancias, el valor del cambio de capacitancia de la interfase electrodo-bacterias, a partir de dicho valor de cambio de impedancia,

f) determinar la presencia o la concentración de bacteriófagos de la solución, a partir de dicho valor de cambio de capacitancia mediante la correspondiente curva de calibración que correlaciona dicho valor de cambio de capacitancia con la concentración de bacteriófagos de la solución.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que;

- la adhesión bacteriana de la etapa a) comprende la formación de un biofilm (4) bacteriano de por lo menos una de dichas cepas huéspedes, sobre la superficie de dicho electrodo (2),

- la etapa e) comprende la determinación del valor del cambio de capacitancia (Cb) del biofilm adherido sobre el electrodo (2), siendo dicha capacitancia (Cb) el parámetro del circuito eléctrico equivalente que modela en la interfase dicho biofilm (4),

y por el hecho de que en la etapa f) se determina la presencia o concentración de bacteriófagos a partir del cambio de capacitancia (Cb) de dicho biofilm (4), estando correlacionado dicho cambio de capacitancia (Cb) con la degradación de dicho biofilm (4) por efecto de la lisis.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la adhesión bacteriana de la etapa a) comprende la funcionalización previa de la superficie de dicho electrodo (2) mediante la adsorción de un compuesto destinado a inmovilizar dichas bacterias sobre la superficie del electrodo (2).

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que dicho electrodo (2) de trabajo está integrado en el sustrato de material de un dispositivo micro-electrónico (1) que comprende por lo menos otro electrodo (3) para llevar a cabo medidas de impedancia eléctrica.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo micro-electrónico es un chip sensor (1).

6. Sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, caracterizado por el hecho de que comprende un dispositivo micro-electrónico (1) que incluye por lo menos dos electrodos (2,3) para llevar a cabo medidas de impedancia eléctrica, bacterias de por lo menos una de dichas cepas huésped, adheridas sobre la superficie de por lo menos uno de dichos electrodos (2), y medios de procesamiento y control para determinar, en el circuito equivalente del espectro de impedancias, el cambio de capacitancia de la interfase electrodo/bacterias, siendo producido dicho cambio de capacitancia por efecto de la lisis de las bacterias adheridas sobre el electrodo (2), al ser dichas bacterias infectadas por bacteriófagos.

7. Sistema según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que dichas bacterias forman parte de un biofilm (4) bacteriano adherido sobre la superficie de dicho electrodo (2) y por el hecho de que dichos medios de procesamiento y control determinan el cambio de capacitancia (Cb) del parámetro del circuito eléctrico equivalente que modela en la interfase dicho biofilm (4), estando correlacionado dicho cambio de capacitancia (Cb) con la degradación del mismo biofilm (4) por efecto de la lisis bacteriana.

8. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo micro-electrónico es un chip sensor (1).

9. Dispositivo micro-electrónico sensor que comprende por lo menos un par de electrodos (2,3) para medir cambios de impedancia eléctrica, caracterizado por el hecho de que comprende un biofilm (4) bacteriano adherido sobre la superficie de por lo menos uno de dichos electrodos (2), perteneciendo las bacterias de dicho biofilm (4) a una cepa huesped susceptible de ser infectada por bacteriófagos de especificidad predeterminada a dicha cepa.

10. Dispositivo según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo micro-electrónico es un chip sensor (1).

11. Uso de un dispositivo micro-electrónico sensor (1) que comprende por lo menos un par de electrodos (2,3) integrados en un sustrato de material, para detectar y/o cuantificar, mediante espectroscopia de impedancia electroquímica, bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada.

12. Uso de un dispositivo según la reivindicación 11, en el que dicho dispositivo es un chip sensor (1).

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, en el que dicho dispositivo o chip sensor comprende un biofilm (4) bacteriano adherido sobre su superficie, siendo las bacterias de dicho biofilm (4) de por lo menos una de dichas cepas huésped.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, sistema según la reivindicación 6, dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso de dicho dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son colifagos somáticos o bacteriofagos susceptibles de infectar cepas de Escherichia coli.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, sistema según la reivindicación 6, dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso de dicho dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de bacterias lácticas.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, sistema según la reivindicación 6, dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso de dicho dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 11, en el que dichos bacteriófagos son bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de Pseudomonas putida.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, sistema según la reivindicación 6, dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 9, o uso de dicho dispositivo micro-electrónico según la reivindicación 11, en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de agua.