PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA OBTENER CAROTENO Y CAROTENOIDES DE ALGAS Y CIANOBACTERIAS.

Un procedimiento para la producción de carotenos o carotenoides a partir de algas o cianobacterias,

que comprende

(a) cultivar algas o cianobacterias que tienen capacidad para la biosíntesis de carotenos o carotenoides bajo condiciones adecuadas para el crecimiento vegetal óptimo de dichas células en la llamada "Fase Verde", y

(b) recoger las células así obtenidas y cultivarlas a temperaturas en el intervalo de 5 a 35ºC e intensidades lumínicas de 30 a 200 µE x m-2 x s-1 en la llamada "Fase Roja",

caracterizado porque la intensidad lumínica en la etapa (b) no se incrementa en comparación con la etapa (a) y porque las células cultivadas se someten a estrés químico añadiendo una sustancia que libera especies de oxígeno activas para la inducción de la síntesis de carotenos o carotenoides en una etapa o repetidamente a lo largo de todo el período de la Fase Roja

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05000776.

Solicitante: COGNIS IP MANAGEMENT GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: HENKELSTRASSE 67,40589 DUSSELDORF.

Inventor/es: WEISS, ALBRECHT, SANDER, ANDREAS, JOHANNISBAUER, WILHELM, DR., FRANKE, HORST, MAHNKE,EIKE ULF,DR, PULZ. OTTO,DR. DR. H.C.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 15 de Enero de 2005.

Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23L1/275B2
  • A23L1/30B
  • A61K36/02 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 36/00 Preparaciones medicinales de constitución indeterminada que contienen sustancias procedentes de algas, líquenes, hongos o plantas o sus derivados, p. ej. medicinas tradicionales basadas en plantas. › Algas.
  • C07C403/24 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisis   o electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 403/00 Derivados del ciclohexano o de un ciclohexeno, que contienen una cadena lateral con una parte insaturada de al menos cuatro átomos de carbono en línea, cuya parte está directamente unida a ciclos de ciclohexano o ciclohexeno, p. ej. vitamina A, beta-caroteno, beta-ionona. › que tienen cadenas laterales sustituidas por ciclos no aromáticos de seis miembros, p. ej. beta-caroteno.
  • C07C49/743 C07C […] › C07C 49/00 Cetonas; Cetenas; Dímeros de cetena; Quelatos de cetona. › con insaturación distinta a la de los ciclos, p. ej. humulonas, lupulonas.
  • C12P23/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).

Clasificación PCT:

  • A61K35/74 A61K […] › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Bacterias (uso terapéutico de una proteína de la bacteria A61K 38/00).
  • A61K36/02 A61K 36/00 […] › Algas.
  • C12P23/00 C12P […] › Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).
  • C12R1/01 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Bacterias o actinomicetos.
  • C12R1/89 C12R 1/00 […] › Algas.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

Procedimiento mejorado para obtener caroteno y carotenoides de algas y cianobacterias.

Objetivo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para obtener carotenos o carotenoides de algas o cianobacterias, especialmente para la fabricación de astaxantina a partir de cepas de Haematococcus.

Estado de la técnica

El cultivo de algas, particularmente Haematococcus pl., para la producción de carotenos y carotenoides, por ejemplo, beta-caroteno o astaxantina, se divide en la llamada "Fase Verde", que se dirige al crecimiento de la masa de algas, y una "Fase Roja", para la producción de los carotenoides en las células. Ambas partes del procedimiento de cultivo tienen que optimizarse para dar tanto carotenoide como sea posible por unidad de tiempo en un volumen de fotobiorreactor dado. Una visión de conjunto se da en: Amos Richmond, "Handbook of micro-algae culture: Biotechnology and Applied Physiology", pp 70-72 (2004), Blackwell Science Ltd, Oxford, donde también se analiza la influencia negativa de altas concentraciones de oxígeno en el cultivo del alga Spirulina y se indica una fotoinhibición para la producción.

EP 0877817 B1 (Ben Gurion University) se refiere a un procedimiento para la producción a gran escala de astaxantina a partir de Haematococcus. Con más detalle, la patente muestra un procedimiento de cultivo bifásico, la primera fase proporciona el mantenimiento de un crecimiento vegetativo óptimo de las células bajo condiciones ambientales controladas. Este primer estadio o fase se caracteriza porque las células tienen división celular continua y una relación astaxantina/clorofila entre aproximadamente 0,1 y 0,4, y un incremento en el contenido de clorofila durante el procedimiento de cultivo. En la segunda fase de este procedimiento, se alcanzaba la inducción de la producción y la acumulación de astaxantina dentro de las células al recoger las células del cultivo de células verdes anterior y someterlas a estrés mediante privación de nutrientes al resuspender las células en agua corriente enriquecida con CO2, seguido por el cultivo de las células bajo exposición a altas intensidades lumínicas, p. ej., luz solar completa.

Boussiba describe la carotenogénesis en el alga verde Haematococcus pluvialis [Physiol. Plant 108: 111-117 (2000)] y ha estudiado las diversas condiciones de estrés ambiental, como intensidades lumínicas, limitaciones de nitrógeno y fosfato y estrés salino. Sugiere que además de las altas intensidades lumínicas, las especies de oxígeno reactivas, p. ej., radicales oxígeno generados a través de la adición de colorantes fotosensibilizadores a la suspensión de cultivo, median en la inducción de la síntesis de astaxantina.

También se hace referencia a Biotechnology Letters, Vol. 23(7), p. 519-523 (2001). Este documento divulga un procedimiento de acuerdo con el cual la microalga Chlorococcum sp. se somete a estrés químico mediante la adición de peróxido de hidrógeno para mejorar la estimulación de la producción de astaxantina. Sin embargo, el sometimiento a estrés tiene lugar durante la llamada "Fase Verde".

Los costes de producción de los carotenos y carotenoides, p. ej. beta-caroteno, licopeno, luteína y especialmente astaxantina, a partir de algas son altos debido a los grandes volúmenes de reactor y las altas intensidades lumínicas para cada célula de alga en la llamada Fase Roja. Habitualmente, la luz no puede penetrar más de aproximadamente 5 cm en fermentaciones de algas de alta densidad. Estas condiciones lumínicas óptimas para la Fase Roja no están disponibles en Europa del norte.

Por lo tanto, el objetivo que subyace a la presente invención ha sido desarrollar un procedimiento para producir carotenoides, particularmente astaxantina, en la Fase Roja con aproximadamente las mismas intensidades lumínicas bajas que en la Fase Verde para producir económicamente carotenoides también bajo las condiciones lumínicas europeas. Por lo tanto, más particularmente, los principales propósitos han sido

• Separación del cultivo en dos etapas principales, de modo que cada etapa pueda llevarse a cabo en reactores separados usando diferentes medios de cultivo,

• Adición controlada de nutrientes que contienen C en la fase de crecimiento (Fase Verde),

• Procedimiento controlado de división celular y agrandamiento celular (Fase Verde),

• Inducción de síntesis de astaxantina bajo las mismas condiciones lumínicas bajas después de la reducción de nutrientes y fertilizantes cuando se cambia a la Fase Roja.

Descripción de la invención

La presente invención reivindica un procedimiento mejorado para la producción de carotenos o carotenoides a partir de algas o cianobacterias, que comprende

(a) cultivar algas o cianobacterias que tienen capacidad para la biosíntesis de carotenos o carotenoides bajo condiciones adecuadas para el crecimiento vegetal óptimo de dichas células en la llamada "Fase Verde", y

(b) recoger las células así obtenidas y cultivarlas [a temperaturas en el intervalo de 5 a 35ºC e intensidades lumínicas de 30 a 200 µE x m-2 x s-1 en la llamada "Fase Roja",

que se caracteriza porque la intensidad lumínica en la etapa (b) no se incrementa en comparación con la etapa (a) y porque las células cultivadas se someten a estrés químico añadiendo una sustancia que libera especies de oxígeno activas para la inducción de la síntesis de carotenos o carotenoides en una etapa o repetidamente a lo largo de todo el período de la Fase Roja.

Para solucionar el problema descrito anteriormente, el solicitante ha llevado a cabo una investigación sistemática para optimizar las condiciones de reacción en las Fases Verde así como en la Roja. La fase de crecimiento se ha establecido como cultivo mixotrófico con la adición controlada de nutrientes como glucosa o acetato sódico además del uso de dióxido de carbono para asegurar un crecimiento celular rápido. Mediante este método, la velocidad de crecimiento o la productividad para la masa de algas se mejoraba en un factor de 5 a 10. Para mejoras adicionales de la fase de crecimiento se ha encontrado ventajoso tener dos estadios con

(i) división celular controlada y

(ii) engrandecimiento de las células pequeñas antes de cambiar a la Fase Roja (producción de carotenoides).

También se han probado diferentes factores de estrés para inducir la formación de carotenoides en la Fase Roja. Las algas se preparan para que sobrevivan, y una teoría generalmente analizada es que los carotenoides se producen para proteger al fotosistema de las algas. Por lo tanto, un enfoque común del estado de la técnica ha sido comenzar la Fase Roja con una intensidad lumínica muy superior en comparación con la Fase Verde.

Sorprendentemente, el solicitante ha encontrado que puede alcanzarse un nivel de producción aún mayor de carotenoides en general, y más particularmente de astaxantina, manteniendo las mismas condiciones lumínicas a lo largo de toda la fermentación (Fases Verde y Roja) si la suspensión de algas se somete a estrés químico añadiendo sustancias que liberan especies de oxígeno activas, particularmente mediante la adición de peróxidos, y más particularmente peróxido de hidrógeno. De acuerdo con el procedimiento de la invención, se alcanza una inducción potenciada de la ruta de carotenoides, que conduce a un nivel superior de enzimas directamente implicadas en el metabolismo. Esto lleva consigo una biosíntesis potenciada de carotenoides en general, y más particularmente de astaxantina.

Los mejores resultados alcanzados mediante la adición de peróxido de hidrógeno daban como resultado una reducción económicamente importante del tiempo de cultivo en un factor de 5 a 8 para alcanzar las mismas concentraciones de astaxantina en comparación con una inducción de alta intensidad lumínica con la misma cepa. Por ejemplo, en total, los costes de fabricación de algas que contenían de 3 a 4% en peso de astaxantina podrían reducirse en un factor de 5 a 10 frente al estado de la técnica conocido de la bibliografía.

Carotenos y carotenoides

Los carotenos representan un grupo de tetraterpenos insaturados que tienen de 11 a 12 dobles enlaces. De principal importancia son los tres carotenos isómeros a, ß y ?, que muestran todos la misma estructura que comprende 9 dobles enlaces conjugados y un...

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la producción de carotenos o carotenoides a partir de algas o cianobacterias, que comprende

(a) cultivar algas o cianobacterias que tienen capacidad para la biosíntesis de carotenos o carotenoides bajo condiciones adecuadas para el crecimiento vegetal óptimo de dichas células en la llamada "Fase Verde", y

(b) recoger las células así obtenidas y cultivarlas a temperaturas en el intervalo de 5 a 35ºC e intensidades lumínicas de 30 a 200 µE x m-2 x s-1 en la llamada "Fase Roja",

caracterizado porque la intensidad lumínica en la etapa (b) no se incrementa en comparación con la etapa (a) y porque las células cultivadas se someten a estrés químico añadiendo una sustancia que libera especies de oxígeno activas para la inducción de la síntesis de carotenos o carotenoides en una etapa o repetidamente a lo largo de todo el período de la Fase Roja.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se cultivan algas que tienen capacidad para la biosíntesis de carotenos o carotenoides seleccionados del grupo que consiste en beta-caroteno, capsantina, bixina, capsorrubina, astaxantina, luteína, licopeno, violaxantina, criptoxantina, anteraxantina, neoxantina, cantaxantina, zeaxantina, fitoeno, fitoflueno, retinol y retinal.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 y/o 2, caracterizado porque se cultivan algas que se seleccionan del grupo que consiste en Dunaliella sp, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Haematococcus sp, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Murielopsis sp, Anabaena spaerica, Chlorella sp, Chlorella zofingiensis, Chlorococcum sp, Neospongiuococcum sp, Coelastrum sp y Scenedesmus sp.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células se someten a las mismas intensidades lumínicas tanto en la Fase Verde como en la Roja en el intervalo de aproximadamente 30 a 200 µE x m-2 x s-1.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células se cultivan tanto en la Fase Verde como en la Roja a una temperatura en el intervalo de 5 a 35ºC.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las algas se hacen crecer mixotróficamente.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque las algas se hacen crecer mixotróficamente en la Fase Verde.

8. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 6 y/o 7, caracterizado porque las algas se hacen crecer mixotróficamente en la Fase Verde y el estrés tiene lugar en ausencia de los nutrientes de la Fase Verde mixotrófica.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las células se someten a estrés químico mediante la adición de sustancias que liberan especies de oxígeno activas seleccionadas de oxígeno singlete, radical oxígeno o peroxicompuestos.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células se someten a estrés químico mediante la adición de peróxido de hidrógeno.

11. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 9 y/o 10, caracterizado porque dichos factores de estrés químico se añaden en una cantidad de 0,05 a 5 mmol por litro de suspensión de cultivo.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dichas células se inoculan en una solución de crecimiento que consiste en agua corriente a la que se añade dióxido de carbono.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque dichas células se cultivan en un fotobiorreactor.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho fotobiorreactor es un biorreactor tubular o de panel.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la concentración inicial de células usada para el cultivo es de aproximadamente 0,1 a 0,3 x 106 células/ml a concentraciones de células (masa seca) durante el cultivo del procedimiento de entre 0,1-8 g de biomasa seca/l.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende las siguientes etapas adicionales:

(c) recolectar las células cultivadas en la etapa (b) recogiendo dichas células para formar una suspensión concentrada,

(d) añadir antioxidantes y/o emulsionantes a dicha suspensión, rompiendo las células recogidas y secándolas para obtener un producto enriquecido en carotenos o carotenoides.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque la recogida y la concentración de dichas células se llevan a cabo mediante sedimentación seguida por centrifugación o filtración bajo vacío, y en el que el secado de dichas células se realiza mediante liofilización, secado y trituración combinados o secado por aspersión.

18. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 y/o 17, caracterizado porque los antioxidantes se seleccionan del grupo que consiste etoxiquina, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado (BHT), tocoferoles, di-terc-butil-paracresol y galato de propilo.


 

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