PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE DERIVADOS DE L-FENILALANINA MEDIANTE MICROORGANISMOS.

Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina representado por la fórmula (1) **(Ver fórmula)** en el que R 1 ,

R 2 , R 3 , R 4 y R 5 representan, cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo alcoxi cuyo grupo alquilo es un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, NR 6 R 7 , en el que R 6 y R 7 representan, cada uno independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R 6 y R 7 pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo contener dicho anillo un heteroátomo, o un grupo fenilo que puede tener un sustituyente, siempre y cuando R 1 , R 2 , R 3 , R 4 y R 5 no sean hidrógeno al mismo tiempo, que comprende hacer reaccionar por lo menos un microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un ingrediente del microorganismo o un material tratado con el microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido cinámico representado por la siguiente fórmula (2): **(Ver fórmula)** en el que los símbolos tienen los mismos significados definidos anteriormente

Procedimiento de preparación de derivados de L-fenilalanina mediante microorganismos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina ópticamente activo, el cual se obtiene utilizando la actividad de un microorganismo. Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción que consiste en añadir amoníaco a un derivado del ácido cinámico y obtener de este modo un correspondiente derivado de L-fenilalanina ópticamente activo. El derivado de L-fenilalanina ópticamente activo obtenido mediante el procedimiento según la presente invención resulta útil como material de partida o como intermediario en la síntesis de productos farmacéuticos, productos agroquímicos y otros productos de química fina.

Antecedentes de la técnica

Con respecto al procedimiento para obtener un aminoácido ópticamente activo, se han llevado a cabo muchos estudios sobre la reacción de síntesis orgánica utilizando un catalizador asimétrico, o sobre el procedimiento de preparación fermentativa utilizando la especificidad de los microorganismos.

Uno de los procedimientos de preparación para obtener una fenilalanina ópticamente activa es un procedimiento que consiste en permitir que la fenilalanina amoníaco-liasa, que es una enzima de microorganismos, actúe sobre un ácido cinámico y, de este modo, obtener de forma ópticamente selectiva una fenilalanina ópticamente activa (patente británica 1489468 y JP-A-53-96388). (El término "JP-A", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a "solicitud de patente japonesa publicada no examinada".) Este procedimiento utiliza una reacción enzimática que consiste en añadir un grupo amino a un carbono de un ácido cinámico mediante la acción de una enzima en un sistema con una concentración elevada de amoníaco, en el que la L-fenilalanina se puede producir con una elevada pureza óptica.

Para obtener un derivado de L-fenilalanina ópticamente activo con un sustituyente en el grupo fenilo, se lleva a cabo un procedimiento que consiste en introducir un sustituyente en el grupo fenilo de L-fenilalanina utilizando diversas reacciones de modificación. Sin embargo, este procedimiento, produce inevitablemente un descenso en el rendimiento o en la pureza debido a una reacción secundaria en la parte distinta del grupo fenilo, y un descenso en la pureza óptica debido al progreso de la racemización bajo condiciones de reacción severas. Además, puesto que la especificidad posicional del sustituyente introducido en el grupo fenilo no puede obtenerse fácilmente, este proceso se ve afectado por un rendimiento reducido y por la dificultad en la separación/purificación y no resulta práctico.

Para superar esto, se puede llevar a cabo un proceso que utiliza fenilalanina amoníaco-liasa y que permite que una enzima actúe en un derivado del ácido cinámico que presenta un grupo fenilo sustituido que presenta un sustituyente deseado introducido previamente. La reacción enzimática se produce en condiciones moderadas y por lo tanto, se puede evitar que el grupo fenilo y el sustituyente en el grupo fenilo sufran efectos perjudiciales por una reacción secundaria, como resultado, se espera que un derivado de L-fenilalanina ópticamente activa pueda obtenerse con una elevada pureza. Sin embargo, la fenilalanina amoníaco-liasa presenta generalmente una especificidad estricta de sustrato y en muchos casos, muestra una reactividad extremadamente baja o prácticamente ninguna reactividad con un sustrato que presente un grupo fenilo sustituido en comparación con la reacción original, que consiste en obtener L-fenilalanina a partir de un ácido cinámico. Sólo se han dado a conocer algunos casos, por ejemplo, un procedimiento que consiste en utilizar un derivado del ácido cinámico con un grupo fenilo fluorado como material de partida y obtener una fenilalanina fluorada ópticamente activa mediante la acción de una enzima (véase JP-A-63-148992), y un procedimiento de obtención de un derivado de fenilalanina utilizando un microorganismo específico del género Rhodotorula (véase patente US nº 5.981.239).

El documento EP 0 152 235 A2 da a conocer un procedimiento para preparar L-fenilalanina utilizando, por ejemplo, un microorganismo perteneciente al género Eurotium, Pellicularia (Thanatephorus) o Gonatobotryum.

La patente US nº 4.562.151 da a conocer la preparación de L-fenilalanina y derivados de la misma, en la que L-fenilalanina amoníaco-liasas de Rhodotorula o Sporobolomyces reaccionan sobre derivados del ácido cinámico.

El documento EP 0 167 411 A2 da a conocer la preparación de fenilalanina haciendo reaccionar ácido cinámico con amoníaco en presencia de una fenilalanina amoníaco-liasa obtenida a partir de un microorganismo perteneciente, por ejemplo, a la especie Cladosporium.

Problemas que debe solucionar la invención

Uno de los objetivos de la presente invención consiste en dar conocer un procedimiento novedoso para obtener, de forma sencilla y fácil, derivados de fenilalanina con una elevada pureza óptica con un sustituyente, partiendo de derivados del ácido cinámico que presentan un sustituyente en el grupo fenilo, utilizando microorganismos.

Exposición de la invención

Los presentes inventores han llevado a cabo intensas investigaciones dirigidas al estudio de microorganismos novedosos de la tierra y en la reactividad de microorganismos conocidos que producen fenilalanina amoníaco-liasa, para encontrar un microorganismo que presente actividad de amoníaco-liasa con una elevada reactividad frente a un derivado del ácido cinámico con un sustituyente en el grupo fenilo. Como resultado, se ha puesto de manifiesto que los microorganismos pertenecientes al género Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus o el género Gonatobotryum tienen capacidad para convertir los derivados del ácido cinámico con diversos grupos fenilo sustituidos en el correspondiente derivado de L-fenilalanina. La presente invención se ha llevado a cabo en base a este descubrimiento.

Hasta el momento, no se ha conocido que los microorganismos pertenecientes al género Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus o el género Gonatobotryum tienen capacidad para convertir los derivados del ácido cinámico con diversos grupos fenilo sustituidos en el correspondiente derivado de L-fenilalanina, y los presentes inventores han descubierto dicha capacidad por primera vez.

La presente invención da a conocer un procedimiento para preparar derivados de L-fenilalanina:

1. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina representado por la fórmula (1)

(en el que R¹, R², R³, R⁴ y R⁵ representan, cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo (un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un grupo alcoxi (el grupo alquilo que constituye el grupo alcoxi es un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, NR⁶R⁷ (en el que R⁶ y R⁷ representan, cada uno independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R⁶ y R⁷ pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo contener dicho anillo un heteroátomo), o un grupo fenilo que puede tener un sustituyente, siempre y cuando R¹, R², R³, R⁴ y R⁵ no sean hidrógeno al mismo tiempo),

que comprende hacer reaccionar, por lo menos, un microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un ingrediente del microorganismo o un material tratado con el microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido cinámico representado por la siguiente fórmula (2):

en el que los símbolos tienen los mismos significados definidos anteriormente.

2. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina...

1. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina representado por la fórmula (1)

en el que R¹, R², R³, R⁴ y R⁵ representan, cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo alcoxi cuyo grupo alquilo es un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, NR⁶R⁷, en el que R⁶ y R⁷ representan, cada uno independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R⁶ y R⁷ pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo contener dicho anillo un heteroátomo, o un grupo fenilo que puede tener un sustituyente, siempre y cuando R¹, R², R³, R⁴ y R⁵ no sean hidrógeno al mismo tiempo,

que comprende hacer reaccionar por lo menos un microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un ingrediente del microorganismo o un material tratado con el microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido cinámico representado por la siguiente fórmula (2):

en el que los símbolos tienen los mismos significados definidos anteriormente.

2. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que R¹, R², R³, R⁴ y R⁵ en la fórmula (1) son, cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo ciano o un grupo hidroxi, pero no son hidrógeno al mismo tiempo.

3. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, utilizando el microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus y el género Gonatobotryum, el cual se cultiva previamente en un medio de cultivo que contiene una fenilalanina o un derivado de fenilalanina.

4. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que, por lo menos, una parte de amoníaco se suministra en forma de carbonato.

5. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el que el pH de la solución de reacción se ajusta de 8,5 a 11 utilizando ácido carbónico o una sal de amonio del mismo.

6. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que, por lo menos, una parte del derivado de L-fenilalanina obtenido se recupera como una sal de amonio.

7. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 4, 5 ó 16, en el que, por lo menos, una parte del derivado de L-fenilalanina obtenido se recupera como un carbonato.

8. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar los microorganismos, ingredientes del microorganismo o material tratado con el microorganismo en la solución de un derivado del ácido cinámico con un contenido del 5% en masa o menor.

9. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el que el derivado de L-fenilalanina es 3-ciano-L-fenilalanina.

10. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el que el derivado de L-fenilalanina es 4-ciano-L-fenilalanina.

11. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el que el derivado de L-fenilalanina es 3-hidroxi-L-fenilalanina.

12. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el que el derivado de L-fenilalanina es 4-hidroxi-L-fenilalanina.

13. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el que el derivado de L-fenilalanina es 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina.

14. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el que el microorganismo utilizado es cualquiera de entre Cladosporium colocasiae, Eurotium chevalieri, Thanatephorus cucumeris y Gonatobotryum apiculatum.

15. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el que el microorganismo utilizado es cualquiera de entre Cladosporium colocasiae IFO 6698, Eurotium chevalieri IFO 4090, Thanatephorus cucumeris IFO 6254 y Gonatobotryum apiculatum IFO 9098.

16. Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina según la reivindicación 5, en el que el ajuste del pH utilizando ácido carbónico o una sal de amonio del mismo se lleva a cabo burbujeando dióxido de carbono en una solución de reacción.