PLANTAS QUE TIENEN UN MAYOR RENDIMIENTO DE SEMILLAS Y METODO PARA LOGRARLO.

Método para incrementar el rendimiento de semillas en una planta,

que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 bajo el control de un promotor capaz de expresar preferencialmente a dicho ácido nucleico en la zona de expansión celular de un brote

La presente invención se relaciona en general con el campo de la biología molecular y también con un método para mejorar el rendimiento de semillas de una planta con relación a aquel de las correspondientes plantas de tipo silvestre. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para mejorar el rendimiento de semillas, por medio de la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3, cuyo ácido nucleico está bajo el control de un promotor preferencialmente expresado en la zona de expansión de la célula de brotes. La presente invención también se relaciona con plantas que comprenden una ciclina D3 aislada de ácido nucleico bajo el control de un promotor preferiblemente expresado en la zona de expansión de la célula de brotes, cuyas plantas han mejorado el rendimiento de semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. La invención también se relaciona con construcciones para uso en los métodos de acuerdo con la invención.

La población mundial siempre en crecimiento y la disminución de la oferta de tierras cultivables disponibles para la agricultura estimulan la investigación agrícola hacia el mejoramiento de la eficiencia de la misma. Un medio convencional para mejoras en los cultivos y en la horticultura utiliza técnicas selectivas de reproducción para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de reproducción tienen varios inconvenientes, a saber, que estas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el paso del rasgo deseable de las plantas madre. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de entregar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos agronómicos u hortícolas económicos mejorados. Se produce un rasgo de interés económico particular. Normalmente se define el rendimiento como la producción mensurable de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diferentes factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semillas y más. El desarrollo de raíces, el consumo de nutrientes y la tolerancia al estrés son también factores importantes en la determinación del rendimiento. El rendimiento del cultivo puede incrementarse optimizando uno de los factores anteriormente mencionados, que puede logarse modificando los mecanismos inherentes de crecimiento de una planta.

Los mecanismos inherentes de crecimiento de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de eventos colectivamente conocidos como el “ciclo celular”. La progresión a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo celular están altamente conservados en levadura, mamíferos, y plantas. El ciclo celular se divide típicamente en las siguientes fases secuenciales: G0-G1 -S -G2 -M. La replicación o la síntesis del ADN generalmente tienen lugar durante la fase S (“S” es por la síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas ocurre durante la fase M (la “M” es por mitosis), con la intervención de fases de crecimiento, G1 (durante la cual las crecen las células antes de la replicación del ADN) y G2 (un período después de la replicación del ADN durante el cual se prepara la célula para la división). La división celular se completa después de citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que están en la fase G0. Las células en esta fase pueden ser estimuladas para reingresar al ciclo celular en la fase G1. La “G” en G1, G2 y G0 significa “crecimiento”. La terminación del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija durante la división celular reciba una copia completa del genoma de los padres. La división celular se controla por dos eventos principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del ADN y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos eventos clave es controlada por un punto de control representado por complejos específicos de proteína (involucrados en la replicación y división del ADN). La expresión de los genes necesarios para la síntesis de ADN en el límite de G1/S es regulada por la familia E2F de factores de transcripción en mamíferos y células vegetales (La Thangue, 1994; Muller y colaboradores, 2001; De Veylder y colaboradores, 2002). La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un complejo E2F/Rb que integra señales y permite la activación de la transcripción de genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por lo tanto el progreso a través del ciclo celular, es conducido por la formación y activación de diferentes proteína serina/treonina quinasas, generalmente denominadas como quinasas dependientes de la ciclina (CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo el momento de la activación muy dependiente de la expresión de la ciclina. El enlazamiento de ciclina induce cambios conformacionales en el lóbulo N-terminal de la CDK de asociación y contribuye a la localización y especificidad del sustrato del complejo. Las CDK monoméricas se activan cuando están asociadas con ciclinas y por lo tanto tienen actividad de quinasa. Los niveles de proteína ciclina fluctúan en el ciclo celular y por lo tanto representan un factor principal en la determinación del momento de activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular media la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (puntos de control).

Las ciclinas pueden agruparse en ciclinas mitóticas (denominadas ciclinas de tipo A y B en eucariotas superiores y las CLB en levadura en ciernes) y ciclinas específicas de G1 (denominadas ciclinas tipo D en mamíferos y las CLN en levadura en ciernes). Las ciclinas tipo H regulan la actividad de las CAK (quinasas que activan CDK). Todos los cuatro tipos de ciclinas conocidos en las plantas fueron identificadas principalmente por analogía con sus contrapartes humanas. En Arabidopsis, se han descrito diez ciclinas de tipo A, nueve de tipo B, diez de tipo D y una de tipo H (Vandepoele y colaboradores, 2002).

Las 10 ciclinas de tipo D se subdividen en siete subclases, D1 hasta D7, lo cual refleja su carencia de gran similitud de secuencia entre sí, lo cual contrasta con las ciclinas de tipo A y de tipo

B.

Únicamente las subclases D3 y D4 tienen diferentes miembros, tres y dos respectivamente. Se ha propuesto previamente la redundancia de las ciclinas de tipo D3 como una explicación para la incapacidad de observar fenotipos mutantes por la desactivación de una ciclina tipo D3 única (Swaminathan y colaboradores, 2000). Las dos ciclinas de tipo D3 están enlazadas a través de una duplicación parcial reciente, que sugiere que estas son funcionalmente redundantes. Se podría mantener una hipótesis similar para las ciclinas de tipo D4, ya que dos de las tres están localizadas en un bloque duplicado.

Una divergencia mucho mayor observada para ciclinas de tipo D comparada con ciclinas de tipo A y B puede reflejar el presunto papel de las ciclinas de tipo D en la integración de señales de desarrollo y señales ambientales en el ciclo celular. Por ejemplo, se ha observado que las ciclinas de tipo D3 responden a hormonas de las plantas, tales como citoquinas y brasinoesteroides, mientras que CYCD2 y CYCD4 se activan más temprano en G1 y reaccionan a la disponibilidad de azúcar (para su revisión, ver Stals e Inzé, 2001).

Se reportó la sobreexpresión del gen CYCD2;1 en tabaco para incrementar la división celular e incrementar el ritmo de crecimiento total de la planta sin alteraciones morfológicas (Cockcroft y colaboradores, 2000).

Se reportó la sobreexpresión en Arabidopsis del gen CYCD3;1 bajo el control de un promotor 35S del CaMV para producir plantas con cotiledones agrandados, un tamaño final de la planta dramáticamente reducido y desarrollo distorsionado. A nivel celular, las células...

1. Método para incrementar el rendimiento de semillas en una planta, que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 bajo el control de un promotor capaz de expresar preferencialmente a dicho ácido nucleico en la zona de expansión celular de un brote.

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicho mayor rendimiento de semillas se selecciona del grupo que consiste de (i) mayor biomasa de las semillas; (ii) mayor número de semillas (llenas); (iii) mayor tamaño de las semillas; (iv) mayor volumen de las semillas; (v) mayor índice de cosecha; y (vi) mayor peso de mil granos.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho ácido nucleico que codifica una ciclina D3 es obtenido de una planta.

4. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha ciclina D3 incluye uno o más y preferiblemente todo de lo siguiente: (i) una caja de ciclina; (ii) un motivo LxCxE más o menos dentro de los primeros 40 aminoácidos; y (iii) una o más y preferiblemente todas las regiones conservadas identificadas por las cajas mostradas en la Figura 2 (se permite una falta de coincidencia dentro de las cajas).

5. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha ciclina D3 es codificada por cualquiera de los ácidos nucleico enlistados en la Tabla 1.

6. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha ciclina D3 es un homólogo que tiene en orden creciente de preferencia al menos 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como la representada por la SEQ ID NO: 2.

7. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha ciclina D3 es como la representada por la SEQ ID NO: 2.

8. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3, cuyo ácido nucleico se selecciona de:

(i) porciones de un ácido nucleico que codifican una ciclina D3;

(ii) variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3; y

(iii) variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3; y en donde dichas porciones, las variantes alternativas de empalme, y las variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 son capaces de enlazarse y activar una CDK de una planta.

9. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho promotor capaz de expresar preferencialmente a dicho ácido nucleico en la zona de expansión celular de un brote tiene un perfil comparable de expresión con un promotor de beta-expansina.

10. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento de semilla con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, cuyo método comprende:

(i) introducir en una planta o célula de una planta un ácido nucleico que codifica una ciclina D3, preferiblemente un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 como el representado por la SEQ ID NO: 1, cuyo ácido nucleico codifica un polipéptido ciclina D3, cuyo polipéptido es preferiblemente como el representado por la SEQ ID NO: 2 y cuyo ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor capaz de expresar preferencialmente a dicho ácido nucleico en la zona de expansión celular de

un brote;

(ii) cultivar la célula de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y crecimiento de una panta madura.

11. Método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicho mayor rendimiento de semillas se selecciona de uno o más de lo siguiente: (i) mayor biomasa de las semillas; (ii) mayor número de semillas (llenas); (iii) mayor tamaño de las semillas; (iv) mayor volumen de las semillas; (v) mayor índice de cosecha; y (vi) mayor peso de mil granos.

12. El uso de un ácido nucleico aislado que codifica una ciclina D3 operativamente enlazado a un promotor capaz de expresar preferencialmente a dicho ácido nucleico en la zona de expansión celular de un brote, en el incremento del rendimiento de semilla.

13. El uso de acuerdo a la reivindicación 12, en donde dicho rendimiento de semilla incluye a uno o más de: (i) mayor biomasa de las semillas; (ii) mayor número de semillas (llenas); (iii) mayor tamaño de las semillas; (iv) mayor volumen de las semillas; (v) mayor índice de cosecha; y (vi) mayor peso de mil granos.

14. El uso de acuerdo a la reivindicación 12 ó 13, en donde dicho ácido nucleico que codifica una ciclina D3 es un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO: 1, o en donde dicha ciclina D3 es un aminoácido como el representado por la SEQ ID NO: 2.