PEPTIDO VEGETAL CON ACTIVIDAD ANTI-MICROBIANA.
Péptido aislado, natural o sintético, caracterizado por que comprende al menos una secuencia seleccionada entre:
- las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 7, en las que el aminoácido en posición 16 es una cisteína o una serina, y
- las secuencias SEC ID Nº 8 a SEC ID Nº 10, en las que el aminoácido en posición 16 y el aminoácido en posición 23 son, independiente o simultáneamente, una cisteína o una serina
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2003/002077.
Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS).
Nacionalidad solicitante: Francia.
Dirección: 3, RUE MICHEL-ANGE,75794 PARIS CEDEX 16.
Inventor/es: ROBY, DOMINIQUE, GALLOIS,PATRICK, HECHT,VALERIE, VAROQUAUX,FABRICE, BLANVILLAIN,ROBERT, PUERTOLAS,DELPHINE, DELORME,VALERIE, DELSENY,MICHEL.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 12 de Mayo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01N37/46 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 37/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos orgánicos que tienen un átomo de carbono que posee tres enlaces a heteroátomos, con a lo más dos enlaces a un halógeno, p. ej. ácidos carboxílicos (conteniendo ácidos ciclopropanocarboxílicos o sus derivados, p. ej. nítrilos de ácidos ciclopropanocarboxílicos, A01N 53/00). › Derivados N-acilados.
- C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
- C07K7/08A
Clasificación PCT:
- A01H5/00 A01 […] › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A01N37/18 A01N 37/00 […] › que contienen el grupo —CO—N , p. ej. amidas o imidas de ácido carboxílico; Sus tioanálogos.
- A01N43/38 A01N […] › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m≥1 y n≥0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › condensados con ciclos carbocíclicos.
- C07K14/415 C07K 14/00 […] › de vegetales.
- C07K16/16 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales vegetales.
- C07K7/08 C07K […] › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
- C12N15/29 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
Clasificación antigua:
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A01N37/18 A01N 37/00 […] › que contienen el grupo —CO—N , p. ej. amidas o imidas de ácido carboxílico; Sus tioanálogos.
- A01N43/38 A01N 43/00 […] › condensados con ciclos carbocíclicos.
- C07K14/415 C07K 14/00 […] › de vegetales.
- C07K16/16 C07K 16/00 […] › contra materiales vegetales.
- C07K7/08 C07K 7/00 […] › con 12 a 20 aminoácidos.
- C12N15/29 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
Fragmento de la descripción:
Péptido vegetal con actividad anti-microbiana.
La presente invención se refiere a nuevos péptidos aislados, naturales o sintéticos, con actividad antimicrobiana, a los polinucleótidos que codifican dichos péptidos, a los vectores que comprenden dichos polinucleótidos, a los microorganismos y a las células transformadas con dichos vectores, a los organismos transgénicos no humanos de los que todas o parte de las células contienen y/o expresan dichos vectores, a las utilizaciones de dichos péptidos y de dichos polinucleótidos, particularmente como agentes anti-microbianos específicos de las plantas, así como a un procedimiento de tratamiento anti-microbiano de las plantas.
En la técnica anterior se conocen péptidos de origen vegetal con actividad anti-microbiana. A este respecto, pueden mencionarse los péptidos con actividad lítica tales como defensinas, cecropinas, tioninas, melitinas, obtenidas de mamíferos o también defensinas, magaininas, attacinas, dipterinas, sapecinas, caerulinas, xenopsinas, aisladas a partir de insectos. También se han descrito híbridos de estos péptidos.
También se han descrito péptidos de conejo por su actividad anti-microbiana, así como péptidos con actividad hidrolítica como quitinasa o ß-1,3-glucanasa.
Entre los péptidos de origen vegetal, pueden mencionarse los descritos en las patentes WO 93/05153, US 6.147.281, US 6.150.588 o también US 5.424.395.
La solicitud WO 93/05153 describe proteínas aisladas a partir de semillas de plantas de las familias de las brasicáceas, de las compuestas y de las leguminosas, que presentan una actividad antifúngica y, para algunas, una actividad antibacteriana contra las bacterias Gram-positivas.
La patente US 6.147.281 describe péptidos que tienen una actividad anti-microbiana sobre los patógenos de plantas, presentes en las hojas marchitas de cebada. Estos péptidos presentan particularmente una actividad contra Corynebacterium sepedonicum.
La patente US 6.150.588 describe péptidos que tienen una actividad anti-microbiana sobre los patógenos de plantas y que pueden aislarse a partir de semillas de Aralia o de Impatiens.
La patente US 5.424.395 describe péptidos derivados de magainina 2 que tienen una actividad anti-microbiana sobre patógenos de plantas.
Los péptidos presentes normalmente en las plantas y que presentan una actividad anti-microbiana constituyen una clase de agentes de lucha biológica contra los agentes patógenos particularmente interesante. La identificación de nuevos compuestos derivados de plantas, susceptibles de presentar una actividad anti-microbiana específica frente a las plantas permite prever el desarrollo de nuevos biopesticidas que constituyen una reserva de productos en caso de aparición de resistencia. Es en este marco donde se sitúa la presente invención.
De manera sorprendente e inesperada, los Inventores aislaron en Arabidopsis thaliana un péptido que presenta la particularidad de tener una actividad anti-microbiana, particularmente contra los agentes patógenos de las plantas. En su actividad anti-microbiana, dicho péptido presenta una actividad al menos bacteriostática, eventualmente bactericida. Muy particularmente, dicho péptido presenta una actividad anti-microbiana específica de algunas especies bacterianas, particularmente de especies patógenas de las plantas, como por ejemplo Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae o también Erwinia amylovora.
La actividad anti-microbiana puede manifestarse en forma de dos acciones distintas: inhibición "microbicida" (bactericida, virucida o fungicida), que consiste en matar a dichos microorganismos; e inhibición "microbiostática" (bacteriostática, virostática o fungistática) que consiste en reducir o en inhibir las capacidades de proliferación de dichos microorganismos.
Por consiguiente, la invención tiene por objeto un péptido aislado, natural o sintético, que comprende al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 10 siguientes:
SEC ID Nº 1: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1
SEC ID Nº 2: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala
SEC ID Nº 3: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe
SEC ID Nº 4: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg
SEC ID Nº 5: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu
SEC ID Nº 6: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg
SEC ID Nº 7: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu
SEC ID Nº 8: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2
SEC ID Nº 9: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2-His
SEC ID Nº 10: Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ile-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2-His-Leu
en las que R1 y R2 representan, independiente o simultáneamente, una cisteína o una serina.
El péptido de acuerdo con la invención comprende al menos la secuencia SEC ID Nº 1.
De acuerdo con una realización ventajosa de la invención, dicho péptido consiste en una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 10, tales como se han definido anteriormente.
Por aislado, se entienden en este documento cualquier péptido, sea cual sea su origen, que se habrá, a partir de su fuente, sometido a al menos una etapa de enriquecimiento. De este modo, la invención abarca tanto extractos en bruto, por ejemplo, de vegetales o de células vegetales, que contienen al menos un péptido de acuerdo con la invención, como formas de éste mucho más puras.
De manera ventajosa, el péptido de acuerdo con la invención puede ser aislado de plantas (por ejemplo, Arabidopsis thaliana) u obtenido mediante síntesis química o también mediante medios biotecnológicos como, por ejemplo, a partir de microorganismos, de células de plantas o de animales, incluso de organismos modificados, que normalmente no expresan dicho péptido.
La invención también tiene por objeto un péptido aislado, cuya secuencia es sustancialmente homóloga a al menos una de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 10, tales como se han definido anteriormente.
Se considera en este documento que un péptido presenta una secuencia sustancialmente homóloga cuando su secuencia de aminoácidos presenta al menos el 60% de similitud con la secuencia de aminoácidos de al menos una de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 10 y que el péptido ha conservado su actividad inicial anti-microbiana, particularmente su actividad específica frente a microorganismos patógenos de plantas.
Por 60% de similitud entre un péptido P y las secuencias SEC ID Nº 1 a 10, se entiende que, cuando los dos péptidos están alineados, el 60% de los aminoácidos de P son idénticos al aminoácido correspondiente de las secuencias SEC ID Nº 1 a 10, o se sustituyen por un aminoácido del mismo grupo.
Por aminoácido del mismo grupo, se entiende un aminoácido que posee propiedades químicas prácticamente idénticas. En particular, se entiende por esta expresión aminoácidos que tienen prácticamente la misma carga y/o el mismo tamaño, y/o la misma hidrofilia o hidrofobicidad y/o la misma aromaticidad.
Dichos grupos de aminoácidos incluyen particularmente;
Pueden preverse otras sustituciones, en las que se sustituye un aminoácido por otro aminoácido comparable pero no...
Reivindicaciones:
1. Péptido aislado, natural o sintético, caracterizado por que comprende al menos una secuencia seleccionada entre:
2. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que consiste en una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 10.
3. Péptido aislado, natural o sintético, caracterizado por que su secuencia presenta al menos el 60% de identidad con una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 7, en las que el aminoácido en posición 16 es una cisteína o una serina, y SEC ID Nº 8 a SEC ID Nº 10, en las que el aminoácido en posición 16 y el aminoácido en posición 23 son, independiente o simultáneamente, una cisteína o una serina, y por que conserva una actividad anti-microbiana.
4. Péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos un grupo funcional libre, amino y/o carboxilo, está protegido por un grupo protector.
5. Péptido de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el grupo carboxilo C-terminal y/o los demás grupos carboxilos presentes en la molécula están en forma de un éster o de una amida.
6. Péptido de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el grupo amino N-terminal, y/o los demás grupos amino libres presentes en la molécula, están en forma acilada.
7. Composición que comprende al menos un péptido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 y al menos un vehículo apropiado.
8. Utilización de al menos un péptido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de una composición anti-microbiana, dirigida contra los agentes patógenos de plantas.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que la composición anti-microbiana está dirigida contra Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae o Erwinia amylovora.
10. Utilización de al menos un péptido que comprende o que consiste en al menos una secuencia seleccionada entre:
para la preparación de una composición citotóxica, particularmente para las células vegetales.
11. Utilización de al menos un péptido que comprende o que consiste en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 8 a SEC ID Nº 10, en las que los aminoácidos en las posiciones 16 y 23 son dos serinas, para la preparación de una composición citotóxica, particularmente de una composición citotóxica para las células vegetales.
12. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizada por que dicha composición es una composición herbicida.
13. Utilización de al menos un péptido que comprende o que consiste en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 8 a SEC ID Nº 10, en las que el aminoácido en posición 16 es una cisteína y el aminoácido en posición 23 es una serina, para la preparación de una composición anti-microbiana no citotóxica, particularmente de una composición anti-microbiana no citotóxica dirigida contra los agentes patógenos de plantas.
14. Polinucleótido aislado, natural o sintético, caracterizado por que consiste en una secuencia que codifica al menos uno de los péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que consiste en una secuencia seleccionada entre:
16. Composición que comprende al menos un polinucleótido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 y al menos un vehículo apropiado.
17. Vector que comprende al menos uno cualquiera de los polinucleótidos descritos en las reivindicaciones 14 ó 15.
18. Vector de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que se trata de un vector plasmídico.
19. Utilización de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 o de un vector tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, para la preparación de un péptido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
20. Sistema biológico modificado, caracterizado por que está constituido por un microorganismo, un endofito, una levadura o una célula eucariota y por que contiene al menos uno de los vectores tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, y/o al menos uno de los polinucleótidos tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
21. Composición que comprende al menos un sistema biológico tal como se describe en la reivindicación 20 y al menos un vehículo apropiado.
22. Utilización de al menos un sistema biológico tal como se describe en la reivindicación 20 o de una composición tal como se describe en la reivindicación 21, para la preparación de una composición anti-microbiana, particularmente de una composición anti-microbiana dirigida contra los agentes patógenos de plantas y/o para la preparación de una composición citotóxica.
23. Utilización de al menos un polinucleótido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, o de al menos un vector tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en la preparación de un sistema biológico modificado constituido por un microorganismo, un endofito, una levadura o una célula eucariota.
24. Organismo transgénico no humano, caracterizado por que todas o parte de sus células contienen al menos un polinucleótido tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, o al menos un vector tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18.
25. Organismo transgénico de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado por que se trata de un vegetal.
26. Anticuerpo, policlonal o monoclonal, dirigido contra al menos uno de los péptidos tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
27. Procedimiento de tratamiento anti-microbiano y/o citotóxico de vegetales, en el que se pone en contacto mediante cualquier medio apropiado un organismo, particularmente un vegetal, y al menos un agente anti-microbiano, y/o citotóxico seleccionado entre al menos uno de los péptidos tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y/o uno de los vectores tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, y/o los polinucleótidos tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, y/o uno de los sistemas biológicos modificados tales como se describen en la reivindicación 20 y/o un organismo transgénico, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25 o las composiciones tales como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 7, 16 ó 21.
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