PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE POBLACIONES CELULARES CARACTERIZADAS DE ORIGEN MUSCULAR Y SUS USOS.

Procedimiento de preparación de una composición destinada a la terapia celular en el ser humano,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a) cortar una biopsia de tejido musculoesquelético, b) disociar enzimáticamente las fibras y células musculares y separar las células individualizadas mediante filtración, c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un reactor de cultivo de células adherentes en presencia de un medio que comprende MCDB 12 0 y L-valina sustituida por D-valina, hasta la obtención de una población de células que comprende células CD56+ como tipo celular predominante, siendo predominante dicho tipo celular cuando la proporción de ese tipo celular en dicha población de células supera el 50%, comprendiendo dicho cultivo, dado el caso, una o varias fases de expansión, d) recoger la población de células obtenida en la etapa c), e) dado el caso, congelar la población de células recogidas en la etapa d)

Procedimiento de obtención de poblaciones celulares caracterizadas de origen muscular y sus usos.

La terapia celular es una técnica con un gran potencial para el tratamiento de numerosas patologías. El principio de la terapia celular se basa en la posibilidad de reconstituir un tejido dañado o de restaurar una función biológica perdida o alterada en el seno de un tejido, a partir de células específicas cultivadas ex vivo y trasplantadas en el tejido enfermo. Otro interés de la terapia celular es la posibilidad de usar las células trasplantadas como plataforma de administración de un producto biológicamente activo, si es necesario tras la modificación genética de las células antes del trasplante. Se han descrito numerosos ensayos de terapia celular a partir de cultivos primarios de diferentes tipos celulares. Pueden citarse los trasplantes de células neuronales realizados para el tratamiento de la enfermedad de Huntington (1) o la enfermedad de Parkinson (2), los trasplantes de células de los islotes de Langerhans realizados para el tratamiento de la diabetes (3), o incluso los trasplantes de células mioblásticas realizados para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (4, 5, 6, 7) o tras la modificación genética de las células, para el tratamiento del enanismo (8), de la hemofilia (9) y de la enfermedad de Parkinson (10).

La regeneración del músculo esquelético se garantiza por las células satélite que son células miogénicas mononucleares situadas bajo la lámina basal de las fibras musculares. Tras una lesión, estas células abandonan el estado de quiescencia para entrar en una fase de proliferación activa y reciben el nombre de mioblastos. A continuación, los mioblastos se fusionan para formar los miotubos. Se han realizado ensayos de trasplante de mioblastos en el ser humano para tratar la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker (4, 6, 7, 11). Aunque el efecto funcional de los trasplantes descritos en estos estudios sigue siendo limitado, no se ha notificado ningún efecto secundario en cuanto a infección o carcinogénesis.

Además, se ha considerado el uso de células mioblásticas en el tratamiento de cardiopatías, y en particular de la insuficiencia cardiaca posisquémica. En efecto, al contrario que el tejido muscular, los tejidos miocárdicos carecen de células madre que puedan formar cardiomiocitos y regenerar los tejidos. El tratamiento más radical de la insuficiencia cardiaca posisquémica sigue siendo actualmente el trasplante cardiaco. No obstante, la escasez de injertos limita este uso terapéutico. Por tanto se ha considerado el trasplante de células procedentes de tejidos musculares en el músculo cardiaco como alternativa al trasplante cardiaco. Se han realizado estudios de trasplante de mioblastos en el tejido con infarto de miocardio en la rata, el conejo o el perro (12, 13, 14). Los resultados de estos estudios han demostrado la viabilidad y una cierta eficacia funcional de tales trasplantes. Ensayos de injertos de cardiomiocitos fetales en un modelo de insuficiencia cardiaca de origen yatrogénico en el ratón también han mostrado un cierto beneficio funcional. No obstante, el uso de células fetales presenta, en la perspectiva de aplicación clínica, numerosos problemas éticos, inmunológicos y de abastecimiento celular. El uso de una población de células mioblásticas procedentes del músculo esquelético constituye, por tanto, una alternativa particularmente interesante para la preparación de producto de terapia celular para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca posisquémica, incluso para el tratamiento de cardiopatías de diversos orígenes.

Uno de los tipos celulares más importantes contenido en el tejido muscular es la célula satélite, precursora del mioblasto. Es el tipo celular que se ha usado en los diferentes estudios clínicos. No obstante, el tejido muscular contiene otros tipos celulares. En particular, también podrían usarse ciertas células de origen para la reconstitución de un potencial hematopoyético (15, 16). Un estudio in vitro también ha demostrado la presencia en el músculo humano de progenitores susceptibles de diferenciarse a largo plazo en tejidos cartilaginosos u óseos (17). Se describen ejemplos de medios que permiten la diferenciación en tejido adiposo, cartilaginoso u óseo para células madre mesenquimatosas (22).

En consecuencia, teniendo en cuenta las propiedades de diferenciación de las células de origen muscular, el uso de estas células en terapia celular parece interesante para el tratamiento de numerosas lesiones que afectan a los tejidos del sistema hematológico e inmunológico, los tejidos óseo, adiposo, cartilaginoso, muscular o vascular.

Una de las principales dificultades de la terapia celular sigue siendo la obtención de una población de células suficientemente grande, homogénea y cuyo grado de diferenciación esté adaptado para el efecto deseado.

Se describen procedimientos de preparación celular mioblástica y su uso en terapia celular en el estado de la técnica (4, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27). La mayoría de los procedimientos comprenden:

- una etapa de toma de muestras de tejidos musculares mediante biopsia,

- una etapa de corte,

- una etapa de disociación de las fibras musculares mediante acción enzimática,

- una etapa de separación de las células individualizadas mediante filtración,

- una etapa de selección de las células mioblásticas mediante clonación o mediante separación celular.

Con el fin de obtener una población suficientemente densa y rica, incluso poblaciones puras en células mioblásticas, se ha propuesto seleccionar las células mioblásticas basándose en la expresión de marcadores específicos. Por tanto, la selección de las células mioblásticas puede realizarse mediante la clonación de las células y la posterior caracterización de los clones obtenidos mediante citofluorimetría y después selección de las células musculoesqueléticas que expresan el antígeno CD56 (7). También se describen un método directo de separación de las células mioblásticas que expresan el antígeno CD56 mediante citofluorimetría de flujo y sus ventajas para la obtención de un cultivo puro de mioblastos en el estado de la técnica (21).

A continuación se cultivan las células conservadas en un medio de cultivo modificado y especialmente adaptado para el cultivo de mioblastos (23).

La presente invención resulta de la observación de que las células procedentes del tejido musculoesquelético presentan un potencial de regeneración de numerosos tejidos en función de su grado de diferenciación. La invención propuesta permite, por tanto, proporcionar poblaciones celulares bien caracterizadas de origen muscular.

La presente invención proporciona un procedimiento de obtención de una población celular que comprende un tipo celular predominante, a partir de una biopsia de tejido muscular, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a) tomar muestras y cortar una biopsia muscular,

b) disociar enzimáticamente las fibras y de las células musculares y separación de las células individualizadas mediante filtración,

c) poner en cultivo las células de origen muscular así obtenidas en un reactor de cultivo de células adherentes en presencia de un medio que comprende MCDB 120 y L-valina sustituida por D-valina seguido dado el caso por una o varias fases de expansión,

d) identificar los tipos celulares presentes en los diferentes estadios de cultivo mediante el análisis de marcadores celulares específicos,

e) elegir el estadio de cultivo durante el cual el tipo celular buscado está en proporción predominante en la población de células,

f) recoger una población de células en el estadio de cultivo elegido en e),

g) dado el caso, congelar las células tomadas como muestra en la etapa elegida.

La etapa d) es opcional en la medida en que, cuando se usa el procedimiento varias veces en las mismas condiciones, el investigador conoce los tipos celulares presentes en los diferentes estadios de cultivo y sus proporciones relativas sin tener que repetir la etapa de identificación.

En efecto, se ha constatado que la etapa de identificación (d) conduce a resultados sensiblemente idénticos cuando se repite el mismo procedimiento.

En un modo de realización particular de la invención, el procedimiento comprende además la puesta en práctica de técnicas de empobrecimiento...

1. Procedimiento de preparación de una composición destinada a la terapia celular en el ser humano, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la población de células recogidas comprende de 50 x 10⁶ células a 800 x 10⁹ células, preferiblemente al menos 500 x 10⁶ células, entre las que las células mioblásticas que expresan el marcador CD56 constituyen dicho tipo celular predominante.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la población de células recogidas comprende al menos el 50%, preferiblemente el 60% y mejor el 70% de células mioblásticas que expresan el marcador CD56.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque dicho medio contiene un glucocorticoide y bFGF.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la composición está destinada a la reconstitución en el ser humano de un tejido musculoesquelético, cardiaco o visceral.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la composición está destinada al tratamiento en el ser humano de la insuficiencia cardiaca posisquémica.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la composición está destinada al tratamiento de una distrofia muscular congénita o adquirida.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque dicha etapa de corte está asistida por la ayuda de trituradoras de cuchillas, mecánicos o eléctricos.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque comprende además una etapa de empobrecimiento de las células CD34+.

10. Producto de terapia celular para su uso en el tratamiento de una patología cardiaca en el ser humano, que comprende una población de 500-10⁶ a 800-10⁹ células, comprendiendo dicha población al menos el 50% de células CD56+.

11. Producto de terapia celular según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha población comprende al menos el 60% de células CD56+.

12. Producto de terapia celular según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha población comprende al menos el 70% de células CD56+.

13. Producto de terapia celular según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque dicho tratamiento de una patología cardiaca es un tratamiento mediante la reparación de un tejido cardiaco en el ser humano.

14. Producto de terapia celular según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque dicha patología cardiaca es una insuficiencia cardiaca posisquémica.

15. Producto de terapia celular según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho tratamiento de una insuficiencia cardiaca posisquémica se realiza de manera concomitante a un tratamiento mediante un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (ACEI).

16. Producto de terapia celular según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque dicho tratamiento de una patología cardiaca es un tratamiento mediante trasplante autólogo.

17. Uso de una población celular tal como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, para la producción de un producto de terapia celular destinado al tratamiento de una patología cardiaca.

18. Medio de cultivo que comprende MCDB 120 y L-valina sustituida por D-valina.

19. Medio de cultivo según la reivindicación 18, que no comprende rojo de fenol y no comprende timidina.

20. Uso in vitro del medio de cultivo según la reivindicación 18 ó 19, para la diferenciación de células de tejido musculoesquelético en mioblastos.

21. Uso in vitro del medio de cultivo según la reivindicación 18 ó 19, para la obtención de una población celular que comprende un tipo celular predominante elegido de las células CD34+, las células CD15+, las células CD56+, las células HLA de clase 1, siendo predominante dicho tipo celular cuando la proporción de ese tipo celular supera el 50%.

22. Uso según la reivindicación 21, caracterizado porque dicho tipo celular predominante se elige de las células CD34+, las células CD15+, las células CD56+.

23. Uso in vitro del medio de cultivo según la reivindicación 18 ó 19, para la producción de un producto de terapia celular que comprende una población de células que comprenden células CD56+ como tipo celular predominante, siendo predominante dicho tipo celular cuando la proporción de ese tipo celular en dicha población de células supera el 50%.