NUEVOS GENES ESPECIFICOS DE LA CAPA DE CELULAS BASALES DE TRANSFERENCIA DEL ENDOSPERMO (BETL).

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína específica de la capa basal de células de transferencia del endospermo (BETL) seleccionada del grupo que consiste en:

(a) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 2; y

(b) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos como la dada en SEQ ID NO: 1

Nuevos genes específicos de la capa de células basales de transferencia del endospermo (BETL).

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas específicas de la capa basal de células de transferencia del endospermo (BETL) de las plantas así como a secuencias reguladoras que regulan naturalmente la expresión de tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención proporciona también vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, en las cuales las moléculas de ácido nucleico están unidas operativamente a elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas y/o eucariotas así como proteínas codificadas por dichas moléculas de moléculas de ácido nucleico, anticuerpos para dichas proteínas y métodos para su producción. La presente invención se refiere también a moléculas de ADN recombinantes y vectores que comprenden dichas secuencias reguladoras así como a células hospedadoras transformadas con ellos.

La presente invención se refiere también a métodos para la identificación de compuestos que son capaces de activar o inhibir la expresión de genes específicos de BETL. Adicionalmente, la presente invención se refiere a células de plantas transgénicas, tejidos de plantas y plantas que contienen las moléculas de ácido nucleico arriba descritas, secuencias reguladoras, moléculas de ADN recombinante y vectores así como al uso de las moléculas de ácido nucleico, secuencias reguladoras, moléculas de ADN recombinante, vectores, proteínas y/o anticuerpos mencionados anteriormente, identificados por el método de la invención en las células de las plantas y cultivos de tejidos, la reproducción de plantas y/o la agricultura.

Existen muchos ejemplos en la bibliografía de promotores aislados de plantas que exhiben expresión específica de tejidos cuando se introducen en plantas transgénicas. En la mayoría de los casos estos experimentos se han llevado a cabo en una de unas cuantas especies de plantas modelo tales como Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana. Sin embargo, existen todavía relativamente pocos ejemplos de promotores de especies monocotiledóneas tales como el maíz, que se haya demostrado retienen su especificidad cuando se introducen de nuevo en el hospedador homólogo o en tabaco o Arabidopsis. Aunque existen ejemplos de promotores que retenían su patrón de expresión específico del endospermo cuando se expresaban como constructos informadores en tabaco transgénico, éstos han conferido todos ellos sitios de expresión de células corona y no de células basales. Así, se han descrito genes que posean expresión específica en células basales y expresión terminal específica en células pilosas. La provisión de tales genes y en particular sus secuencias reguladoras puede tener aplicaciones en varios aspectos de la agricultura, confiriendo en particular características antipatógenas/predadoras a plantas transgénicas.

Así pues, el problema técnico que subyace en la presente invención era cumplir con la necesidad de genes y sus secuencias reguladoras que sean específicos para un cierto tejido y/o células no disponibles hasta ahora.

La solución al problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con ello, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína específica de la capa basal de células de transferencia del endospermo de las plantas (BETL) seleccionada del grupo constituido por:

El término "proteína específica de la capa basal de células de transferencia del endospermo (BETL)", como se utiliza en esta memoria, significa que dicha proteína o su gen codificante debe expresarse predominantemente, de modo preferible exclusivamente, en la región basal del endospermo. Esta área está altamente especializada para facilitar la absorción de solutos durante el desarrollo del grano. El endospermo es el órgano principal de almacenamiento en las semillas de maíz, nutriendo el embrión mientras la semilla se desarrolla y proporcionando nutrientes a la planta joven en germinación. Así pues, la absorción de asimilados por el endospermo en crecimiento es un proceso crítico en el desarrollo de la semilla. No existe ninguna conexión simplástica entre los tejidos materno y embrionario (Thorne, 1985); en lugar de ello, la descarga de floema libera nutrientes en un espacio apoplástico. La absorción de nutrientes por el endospermo de este espacio se ve facilitada por la conversión de las células en la base del endospermo en las células de transferencia, que poseen modificaciones anatómicas tales como la presencia de crecimientos extensivos hacia el interior de la pared celular que aumentan la superficie de la membrana y por consiguiente la capacidad de transporte (Pate y Gunning, 1972). La ausencia de esta capa está correlacionada con tasas reducidas de llenado del grano y aborto eventual de las semillas (Brink y Cooper, 1947; Charlton et al., 1995). Usualmente, dichos genes implicados en este tipo de desarrollo de endospermo se expresan entre 8 y 20 días después de la polinización (DAP). Previamente, un clon de cADN (BETL-1) se aisló de un banco de cADN construido a partir de mRNA de endospermo de maíz de 10 DAP y ha sido caracterizado en detalle (Hueros et al., Plant Cell 7 (1995), 747-757). De acuerdo con la presente invención, otros tres cADNs cuyo mRNA subyacente se expresa específicamente en la capa basal de células de transferencia del endospermo han sido aislados, designados BETL-2, BETL-3 y BETL-4, respectivamente. Sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos se representan en SEQ ID NOs: 1, 3 y 5 y SEQ ID NOs: 2, 4 y 6, respectivamente, y no demuestran homología evidente alguna de secuencia o estructura con la proteína BETL-1 y su cADN codificante. Considerando un aspecto más cercano, las proteínas BETL-1 y BETL-2 comparten, sin embargo algunas características comunes: las secuencias de aminoácidos deducidas comprenden pequeñas proteínas con PM calculado de 7 kD. Las secuencias comienzan con una región hidrófoba que es característica de un péptido de señal y las proteínas codificadas son ricas en cisteína. El polipéptido BETL-1 contiene una copia del motivo de extensina, SPPPP y se encuentra en fracciones de la pared celular. La función de BETL-2 sigue sin estar dilucidada; sin embargo, la proteína tiene dos características interesantes, un sitio potencial de glicosilación y la posibilidad de numerosas formaciones de enlaces disulfuro. Ni BETL-1 ni BETL-2 comparten semejanzas evidentes con secuencias existentes en bases de datos actuales. BETL-1 y BETL-2 tienen homología de secuencia con la familia de los supergenes de defensina de péptidos antimicrobianos, y comparten una débil relación de secuencia entre sí. Estudios que habían sido realizados de acuerdo con la presente invención revelaron adicionalmente que BETL-2 se procesaba tanto en el terminal N como en el terminal C para dar dos productos que diferían en tamaño en 3 kDa.

BETL-4 no está relacionado en secuencia con las otras tres, pero tiene una débil homología de secuencia con la familia Bowman-Birk de inhibidores de proteinasa/alfa-amilasa. Sin embargo, no se ha demostrado hasta ahora ningún papel de inhibición enzimática para la proteína BETL-4. Aparte del endospermo basal, no existe ningún otro sitio de expresión de los genes BETL-1 a 4 en el maíz, pero proteínas similares (defensinas e inhibidores del tipo Bowman-Birk) es probable que estén presentes en otras partes de la planta. Se han consignado defensinas de yemas apicales, pistilos y polen de otras especies de plantas, por ejemplo.

Por "hibridantes" se entiende que tales moléculas de ácido nucleico se hibridan en condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente en condiciones severas tal como han sido descritas por, v.g. Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)).

Por lo anterior, es evidente que las secuencias nucleotídicas representadas en SEQ ID NO: 1, 3 y 5 codifican nuevas proteínas BETL. Por la provisión de la secuencia nucleotídica así como de las que codifican...

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína específica de la capa basal de células de transferencia del endospermo (BETL) seleccionada del grupo que consiste en:

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es RNA, ADN, cADN, ADN genómico o ADN o RNA producidos por síntesis.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en donde la planta es maíz.

4. Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente en condiciones severas con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o con la cadena complementaria de la misma.

5. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El vector de la reivindicación 5 en el cual la molécula de ácido nucleico está unidunida operativamente a elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas y/o eucariotas.

7. Una célula hospedadora que contiene un vector de la reivindicación 5 ó 6 o una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 7 que es una célula bacteriana, de insecto, fúngica, de planta o animal.

9. Un método para la producción de una proteína BETL que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 7 u 8 en condiciones que permiten la expresión de la proteína y recuperar la proteína producida del cultivo.

10. Una proteína BETL codificable por una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o producida por el método de la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína de la reivindicación 10.

12. Un método para la producción de plantas transgénicas, células de plantas o tejidos de plantas que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector de la reivindicación 5 ó 6 en el genoma de dicha planta, célula de planta o tejido de planta.

13. Una célula de planta transgénica que comprende, integrada de manera estable en el genoma, una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que está unidunida operativamente a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de la molécula de ácido nucleico en células de plantas o que se obtiene de acuerdo con el método de la reivindicación 12.

14. Una planta transgénica o un tejido de planta que comprende células de plantas de la reivindicación 13.

15. La planta transgénica de la reivindicación 14 en la cual el nivel de proteína(s) BETL está alterado.

16. Una célula de planta transgénica que contiene integrada de manera estable en el genoma una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o parte de la misma o que se obtiene de acuerdo con el método de la reivindicación 12, en donde la transcripción y/o expresión de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma conduce a la reducción de la síntesis de la proteína de la reivindicación 10 en las células.

17. La célula de planta de la reivindicación 16, en donde la reducción se consigue por un efecto mutante antisentido, de sentido, de ribozima, de co-supresión y/o dominante.

18. Una planta o tejido de planta transgénica que comprende las células de la planta de la reivindicación 16 ó 17.

19. La planta transgénica de la reivindicación 18 que exhibe una deficiencia en proteína(s) BETL.

20. Partes cosechables o material de propagación de plantas de una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15, 18 y 19 que comprenden células de plantas de la reivindicación 13 ó 16 ó 17.

21. Uso de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector de la reivindicación 5 ó 6 para la producción de plantas que exhiben un nivel alterado de proteína(s) BETL o resistencia incrementada a las enfermedades.

22. Una secuencia reguladora capaz de conferir expresión de una secuencia de ADN heterólogo en células de transferencia de la capa basal del endospermo, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en:

23. Una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia reguladora de la reivindicación 22.

24. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 23, en donde dicha secuencia reguladora está unidunida operativamente a una secuencia heteróloga de ADN.

25. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 24, en donde dicha secuencia heteróloga de ADN codifica un péptido, proteína, RNA antisentido, RNA sentido y/o ribozima.

26. Un vector que comprende una secuencia reguladora de la reivindicación 22 o una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25.

27. El vector de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente un marcador de selección para plantas.

28. Una célula transformada con una secuencia reguladora de la reivindicación 22 o una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 o el vector de la reivindicación 26 ó 27.

29. Un método para la producción de plantas transgénicas, células de plantas o tejidos de plantas que comprende la introducción de una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 o el vector de la reivindicación 26 ó 27 en el genoma de dicha planta, célula de planta o tejido de planta.

30. Una célula de planta transgénica que contiene integrada de manera estable en el genoma una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 o un vector de la reivindicación 26 ó 27 o que puede obtenerse de acuerdo con el método de la reivindicación 29.

31. Una planta o tejido de planta transgénica que comprende células de plantas de la reivindicación 30 o que pueden obtenerse por el método de la reivindicación 29.

32. Partes cosechables o material de propagación de una planta de la reivindicación 31 que comprenden células de plantas de la reivindicación 30.

33. Un método para la identificación de un activador o inhibidor de genes expresados específicamente en las células de transferencia de la capa basal del endospermo que comprende los pasos de:

34. El método de la reivindicación 33, que comprende adicionalmente el paso de

35. El método de la reivindicación 33 ó 34, en donde

36. Uso de una secuencia reguladora de la reivindicación 22, una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 y/o un vector de la reivindicación 26 ó 27 para la expresión de proteínas heterólogas en células de la capa de transferencia del endospermo basal, para modificación de la repartición de solutos en el endospermo, para conferir o mejorar la resistencia a las enfermedades, para la mejora de productos derivados del endospermo o para la expresión de enzimas que afectan a la calidad de la fibra de algodón y los aceites aromáticos.