Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra el barrenador del maíz europeo,

donde dicha secuencia de nucleótidos:

(a) tiene una secuencia complementaria que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº:1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65ºC; o

(b) es isocodificante con la secuencia de nucleótidos de (a); o

(c) tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº: 1; o

(d) codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 91% de identidad de secuencia con SEC. ID. Nº:2

Nuevas toxinas Vip3 y sus métodos de uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas toxinas Vip3 de Bacillus thuringiensis, a secuencias de ácido nucleico cuya expresión origina dichas toxinas, y a métodos de preparación y métodos de uso de dichas toxinas y de las secuencias de ácido nucleico correspondientes para controlar insectos.

Antecedentes de la invención

Las plagas vegetales son el principal factor de pérdida mundial de cultivos agrícolas importantes. Aproximadamente 8 mil millones de dólares se pierden cada año sólo en los EE.UU. debido a infecciones de plagas no mamíferas incluidos los insectos. Además de las pérdidas en las cosechas, las plagas de insectos son también una carga económica para los cultivadores de frutas y vegetales, para los productores de flores ornamentales y para los jardineros residenciales.

Las plagas de insectos son controladas principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que actúan inhibiendo el crecimiento de los insectos, evitando que los insectos se alimenten o se reproduzcan o causándoles la muerte. Se puede lograr un buen control de los insectos, pero estos químicos pueden afectar a veces a otros insectos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Esto ha sido parcialmente paliado mediante diversas prácticas de manejo de la resistencia, pero existe una necesidad creciente de agentes alternativos para el control de plagas. Los agentes biológicos para el control de plagas, como las cepas de Bacillus thuringiensis que expresan toxinas plaguicidas como d-endotoxinas, también han sido aplicados a plantas de cultivo con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o complemento a los plaguicidas químicos. Se han aislado los genes que codifican algunas de esas d-endotoxinas y su expresión en huéspedes heterólogos ha demostrado que proporcionan otra herramienta para el control de plagas de insectos importantes desde el punto de vista económico. En particular, la expresión de toxinas insecticidas en plantas transgénicas, como las d-endotoxinas de Bacillus thuringiensis, ha proporcionado una protección eficaz contra determinadas plagas de insectos, y las plantas transgénicas que expresan dichas toxinas se han comercializado permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes químicos para el control de insectos.

En la actualidad, se han identificado otros genes que no son de endotoxinas y se identificaron las proteínas que ellos codifican. Las patentes 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033 y 6,291,156 así como Estruch et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-5394) y Yu et al. (1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536), incorporados en este documento por referencia, describen una nueva clase de proteínas insecticidas denominadas Vip3. Los genes vip3 codifican proteínas de aproximadamente 88 kDa que son producidas y secretadas por el Bacillus durante sus estadios vegetativos de crecimiento (proteínas insecticidas vegetativas, VIP, por sus siglas en inglés). La proteína Vip3 A posee actividad insecticida contra un amplio espectro de plagas lepidópteras, incluidas, pero no exclusivamente, gusano cortador grasiento (BCW, Agrotis ipsilon), gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano cogollero del tabaco (TBW, Heliothis virescens), y gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea). Más recientemente, se encontró que plantas que expresan la proteína Vip3A son resistentes al daño por alimentación causado por plagas de insectos hemípteros. Por lo tanto, la proteína Vip3A exhibe un espectro de actividades insecticidas inigualable. Otras divulgaciones, WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 y WO 99/57282, también identificaron actualmente homólogos de la clase de proteínas Vip3.

El uso continuo de agentes químicos y biológicos para controlar plagas de insectos aumenta la probabilidad de que éstos desarrollen resistencia a dichas medidas de control. Asimismo, sólo unas pocas plagas específicas de insectos son controlables con cada agente de control.

Por consiguiente, sigue siendo una necesidad descubrir agentes de control de plagas nuevos y eficaces que proporcionen un beneficio económico a los granjeros y que sean aceptables para el medio ambiente. Son particularmente necesarios agentes de control que estén dirigidos a un amplio espectro de plagas importantes desde el punto de vista económico, agentes de control que controlen eficazmente cepas de insectos que son o podrían tornarse resistentes a los agentes de control de insectos existentes, y aquellos con mayor potencia en comparación con los agentes de control actuales. Además, también son deseables agentes cuya aplicación reduzca al mínimo la carga sobre el ambiente.

Resumen

La presente invención apunta a la necesidad de nuevos agentes de control de plagas proporcionando nuevos genes y toxinas que son diferentes de los divulgados en las patentes de los Estados Unidos 5,877,012, 6,107,279 y 6,137,033, y en Estruch et al. (1996), y Yu et al. (1997), así como en WO 98/18932, WO 99/33991, WO 99/5782 y WO 98/00546.

En la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos para controlar plagas vegetales. En particular, se proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico vip3 aisladas de Bacillus thuringiensis y secuencias sustancialmente idénticas a éstas, cuya expresión origina toxinas plaguicidas con toxicidad para plagas de insectos importantes desde el punto de vista económico, particularmente plagas de insectos que infectan plantas. La invención apunta además a nuevas toxinas plaguicidas resultantes de la expresión de las secuencias de ácido nucleico, y a composiciones y formulaciones que contengan toxinas plaguicidas, que sean capaces de inhibir la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer y reproducirse, o de limitar el daño relacionado con los insectos o la pérdida de las plantas de cultivo.

La invención se dirige además a métodos de uso de las secuencias de ácido nucleico en plantas transgénicas para conferir protección contra el daño causado por insectos, y a un método de uso de las toxinas plaguicidas y composiciones y formulaciones que comprenden las toxinas plaguicidas, por ejemplo mediante la aplicación de las toxinas plaguicidas o las composiciones o formulaciones para tratar profilácticamente áreas o plantas sensibles a los insectos, a fin de conferirles protección contra las plagas de insectos.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden modificar genéticamente usando métodos conocidos en el área a fin de alterar dichas secuencias de nucleótidos para una diversidad de propósitos que incluyen, pero no exclusivamente, ampliar el espectro de la actividad plaguicida o aumentar la actividad específica contra una plaga específica. Se pueden usar barajado del ADN (transposición de secuencias de ADN por fragmentación aleatoria) y reagrupación por PCR de los fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos.

Las nuevas toxinas plaguicidas descritas en este documento son sumamente activas contra insectos. Por ejemplo, una cantidad de plagas de insectos económicamente importantes, como los lepidópteros Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Diatraea grandiosella (barrenador del maíz del sudoeste), Diatraea saccharalis (barrenador de la caña de azúcar), Helicoverpa punctigera (gusano nativo) y Helicoverpa armigera (gusano de la cápsula del algodón) se pueden controlar con toxinas plaguicidas. Las toxinas plaguicidas se pueden usar solas o en combinación con otras estrategias de control de insectos para conferir máxima eficacia de control de plagas con mínimo impacto sobre el ambiente.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra insectos, donde la secuencia de nucleótidos: (a) tiene un complemento que se hibrida con los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID Nº: 1 en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO₄ 0.5 M, EDTA 1...

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina que es activa contra el barrenador del maíz europeo, donde dicha secuencia de nucleótidos:

2. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1981-2367 de SEC. ID. Nº:1 o SEC. ID. Nº: 3.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina comprende los aminoácidos 681-788 de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 2.

6. Un gen quimérico que comprende una secuencia promotora heteróloga unida operativamente a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector recombinante que comprende el gen quimérico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 6.

9. La célula huésped transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula bacteriana.

10. La célula huésped transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula vegetal.

11. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de la reivindicación 10.

12. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 11, donde la semilla transgénica comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

13. Una toxina aislada que es activa contra el barrenador del maíz europeo, donde el extremo C-terminal de dicha toxina comprende los aminoácidos 661-788 de SEC. ID. Nº: 2, y dicha toxina comprende una secuencia de aminoácidos que:

14. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC. ID. Nº: 2, SEC. ID. Nº: 11 o SEC. ID. Nº: 32.

15. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicha toxina es producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que se expone en SEC. ID. Nº: 1, SEC. ID. Nº: 3, SEC. ID. Nº: 10, SEC. ID. Nº: 31 o SEC. ID. Nº: 33.

16. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina tiene actividad contra un insecto lepidóptero seleccionado del grupo que consiste en Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), Agrotis ipsilon (gusano cortador grasiento), Helicoverpa zea (gusano elotero), Heliothis virescens (gusano cogollero del tabaco), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Pectinophora gossypiella (lagarta rosada), Trichoplusia ni (gusano falso medidor de la col), Cochylis hospes (polilla de bandas del girasol), y Homeosoma electellum (polilla del girasol).

17. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina es producida por una cepa de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consiste en C1674, designada como registro NRRL B-30556; y C536, designada como registro NRRL B-30557.

18. La toxina aislada de acuerdo con la reivindicación 13 o una toxina codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha toxina es producida por un clon de E. coli seleccionado del grupo que consiste en pNOV3910, designado como registro NRRL B-30553; pNOV3911, designado como registro NRRL B-30552; pNOV3906, designado como registro NRRL B-30555; pNOV3905, designado como registro NRRL B-30554; y pNOV3912, designado como registro NRRL B-3055 1.

19. Una composición que comprende una cantidad eficaz para controlar insectos de la toxina de acuerdo con la reivindicación 13.

20. Un método para producir una planta transgénica resistente a los insectos, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en una célula vegetal; y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde dicha planta transformada es resistente a los insectos.

21. Un método para controlar un insecto que comprende suministrar a dicho insecto una cantidad eficaz de la toxina de acuerdo con la reivindicación 13.

22. Una toxina híbrida activa contra el barrenador del maíz europeo, que comprende una región carboxi-terminal de una toxina Vip3 unida en la dirección de amino a carboxi a una región amino-terminal de una toxina Vip3 diferente, donde dicha región carboxi-terminal comprende los aminoácidos 661-788 de la SEC. ID. Nº: 2; y donde dicha región amino-terminal tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-660 de SEC. ID. Nº: 7.