Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(y-glutámico).

Nanoesferas constituidas por ácido poli(y-glutámico) de biosíntesis esterificado con grupos metilo al 100%, o con grupos etilo al 75% o con grupos hexilo, dodecilo u octadecilo al 50%, todos ellos insolubles en agua. Las partículas se obtienen, de forma controlable y reproducible, por el método de precipitación-diálisis. Son hidrolizables en condiciones fisiológicas y permiten la encapsulación homogénea de principios activos, tales como fármacos o proteínas, produciéndose la liberación completa de los mismos en el rango de días

Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico).

Objeto de la invención

Partículas de tamaño nanométrico fabricadas con ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) de biosíntesis, útiles para el encapsulamiento de fármacos. El método de preparación es reproducible, obteniéndose partículas esféricas en las que el agente terapéutico se distribuye de forma homogénea. Para estas partículas se prevén aplicaciones biomédicas en la vectorización y liberación controlada de fármacos.

Antecedentes

Las nanopartículas biodegradables son sistemas de gran interés por sus aplicaciones biomédicas como dispensadores de agentes terapéuticos ya sean de bajo peso molecular o macromoleculares. (Panyam, J., Labhasetwar, V., Adv. Drug Del. Rev., 55, 329, 2003). Diversos polímeros, tanto sintéticos como naturales, han sido utilizados en la preparación de sistemas de liberación y vectorización de compuestos bioactivos, entre estos se encuentran las poliamidas, las cuales son susceptibles de hidrolizarse en condiciones fisiológicas. Los poliglutamatos son biopolímeros que han sido ampliamente utilizados en aplicaciones farmacéuticas (Buescher J. et al. Critical Reviews in Biotechnology, 27, 1, 2007). Sin embargo, son necesarias nuevas formulaciones tecnológicas capaces de producir partículas nanométricas biodegradables y biocompatibles.

El ácido poli(?-glutámico), (PGGA) es un poli(aminoácido) cuyos enlaces amida en la cadena principal están formados a partir del grupo a-amino y del grupo ?-carboxilo. A nivel industrial es producido por varias especies del genero Bacillus. Es soluble en agua, biodegradable, y biocompatible, es decir, que se metaboliza en productos no tóxicos para el organismo. La esterificación de su grupo carboxilo lateral puede conducir a la obtención de polímeros tipo peine, no solubles en agua con propiedades radicalmente diferentes a las del biopolímero de partida (Morillo M. et al., Macromolecules, 34, 7868, 2001).

En concreto, los copolímeros anfifílicos o polímeros hidrofóbicamente modificados están siendo ampliamente investigados en el campo de la biotecnología y la farmacología. Dichos sistemas bajo condiciones adecuadas tienden a constituir estructuras que protegen los agentes terapéuticos de la degradación enzimática, especialmente en el caso de proteínas y péptidos (Takami et al., J. Biomater. Sci., Polymer Edn. 17, 875, 2006). Diferentes estudios muestran que el método de precipitación-diálisis es adecuado para obtener partículas en el rango nanométrico de forma reproducible (Brannon-Peppas L. et al., Advanced drug delivery reviews, 56, 1649, 2004.) Sin embargo según el dispositivo en concreto de que se trate, deben seleccionarse cuidadosamente las condiciones de encapsulación para que se garantice la homogeneidad de la partícula y para que se mantenga la eficiencia del agente terapéutico una vez liberado.

Descripción del invento

Preparación

Las nanoesferas de PAAG-Me, coPAAG-(Et₇₅H₂₅), coPAAG-(Hex₅₀H₅₀), coPAAG-(Dod₅₀H₅₀) y coPAAG-(Octd₅₀H₅₀) (Figura 1) se obtienen mediante el método de precipitación-diálisis. Se ha constatado la reproducibilidad en la obtención de estos nuevos dispositivos, así como, la eficiencia en la nanoencapsulación de compuestos y su posterior liberación controlada. En concreto, la presente invención se refiere a la nanoencapsulación de eritromicina y a-quimotripsina.

Materiales

El poli(?, DL-glutamato) sódico con una proporción enantiomérica de 59:41 y un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 300,000 KD fue biosintetizado por B. subtilis y suministrado por Meiji Co. (Japón). El polímero se llevo a su forma ácida mediante acidificación con HCI y precipitación en 2-propanol. La metilación del PGGA con diazometano (Pérez-Camero G. et al., J Appl Polym Sci., 82, 2027, 2001) permite obtener el PGGA completamente metilado. El resto de las alquilaciones se llevaron a cabo con bromuros de alquilo ajustando las condiciones de reacción para alcanzar los grados de esterificación que se desean (Morillo M. et al., Macromolecules, 34, 7868, 2001. Kubota H. et al. J. Polym. Sci. Part A. Polym. Chem. 33, 85, 1995. Bobérly M. et al. Polym. Bull. 32, 127, 1994).

La eritromicina, ensayo 95%, fue suministrada por Fluka, y la a-quimotripsina de páncreas bovino (EC 3.421.1, Tipo II, 50 unidades mg^-1) y los bromuros de alquilo fueron suministrados por Sigma. Se utilizaron solventes orgánicos de grado analítico y se emplearon sin posterior purificación. El agua utilizada en la preparación de las soluciones amortiguadoras fue desionizada en un equipo "Milli-Q".

Procedimiento general de preparación

Esterificación del ácido poli(?-glutámico)

Para obtener el éster metílico se añade una solución de diazometano en éter (0.25 M) a una disolución de poli(?-glutámico) de biosíntesis, de peso molecular M_w = 300,000 en acetona anhidra y se agita la muestra a temperatura ambiente durante 2 h. Se evapora el solvente a presión reducida obteniéndose el compuesto metilado como un polvo blanco, el cual se disuelve en N-metilpirrolidona (NMP) y se precipita en éter dietílico frío. Dicho polímero se filtra, se lava con éter frío, y se seca a presión reducida.

Para obtener los esteres de grupos alquilo mas largos (etilo, hexadecilo, dodecilo y octadecilo) se emplea la esterificación con los correspondientes bromuros de alquilo. Los copolímeros se obtienen de la siguiente manera: 200 mg (1.55 mmol) de PGGA se disuelve en NMP (20 mL) y se agita a 80ºC por 30 minutos, la mezcla se enfría hasta 60ºC y se añade NaHCO₃ (525 mg, 6.25 mmol) y 8 mmol del correspondiente bromuro de alquilo y se deja reaccionar el tiempo necesario para alcanzar el porcentaje de alquilación deseado, monitoreando la reacción por RMN de protón en un equipo Bruker AMX-300.

El NaBr generado en la reacción se separa por decantación y la mezcla de reacción se vierte en: dietil éter para el coPAAG-(Et₇₅H₂₅), agua acidificada (pH 1.5) para coPAAG-(Hex₅₀H₅₀), hexano para coPAAG-(Dodc₅₀H₅₀) y coPAAG-(Octd₅₀H₅₀), para precipitar el copolímero.

El siguiente paso es la centrifugación para recuperar los copolímeros que se obtienen como polvo fino y finalmente se secan al vacío a 50ºC.

En la Tabla 1 se indican las características de los polímeros utilizados en la preparación de nanoesferas, así como del PGGA de partida.

Preparación de nanoesferas

Las nanoesferas se obtienen por precipitación y diálisis. A una disolución de copolímero en N-metilpirrolidona, se adiciona el mismo volumen de agua destilada obteniéndose una solución translúcida. Esta disolución se dializa frente a agua destilada, formándose las nanopartículas. Finalmente, la solución dializada se liofiliza.

Mediante dispersión láser/PIDS, usando un Beckman Coulter LS 1332, se midió la distribución de tamaño de partícula. Los resultados se muestran en la Figura 2.

La morfología se estudió realizando micrografías de SEM en un instrumento JEOL SSM-6400. Las fotografías se muestran en la Figura 3. a) coPAAG-(Et₇₅H₂₅) b) coPAAG-(Hex₅₀H₅₀) c) coPAAG-(Dod₅₀H₅₀) d) coPAAG-(Octd₅₀H₅₀).

Para encapsular el fármaco en las nanoesferas, se disuelven los copolímeros (30 mg) y la eritromicina (30 mg) en NMP (5 mL) y se lleva a cabo el método de precipitación-diálisis explicado anteriormente. La cantidad de eritromicina encapsulada se mide por espectroscopia UV-vis.

El fármaco se distribuye homogéneamente en la matriz de polímero tal como indican los estudios de calorimetría diferencial de barrido, realizados en un calorímetro DSC Perkin-Elmer Pyris calibrado con indio. La espectroscopia UV- visible realizada con un espectrómetro Cecil CE2021, ha revelado que las nanoesferas presentan, en condiciones fisiológicas, un perfil adecuado de liberación de fármaco frente al tiempo, y cada perfil es dependiente del tipo...

1. Nanoesferas caracterizadas por estar constituidas por ésteres alquílicos derivados del ácido poli(?-glutámico) de origen natural con un 100% de esterificación en el caso del éster metílico, un 75% para el éster etílico y un 50% de esterificación en el caso de ésteres hexilicos, dodecílicos y octadecílicos.

2. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por formarse espontáneamente, mediante el método de precipitación-diálisis.

3. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por obtenerse de forma controlable y reproducible mediante el ajuste de la proporción de polímero, de la naturaleza del disolvente, del tiempo de diálisis y del proceso de aislamiento y purificación.

4. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por ser degradables hidrolíticamente en condiciones fisiológicas.

5. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por ser susceptibles de modular su hidrodegradabilidad en función de la proporción y la naturaleza de los grupos éster alquílicos.

6. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por poder encapsular agentes terapéuticos constituyendo sistemas homogéneos.

7. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas porque para una carga de eritromicina del 100% w/w presentan una capacidad de encapsulación del 43 al 80% w/w, siendo la liberación total de eritromicina entre 10 y 35 días en condiciones fisiológicas, con un perfil sigmoidal muy conveniente para su aplicación biomédica.

8. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas por inmovilizar cantidades de a-quimotripsina entre un 3 y un 25% w/w.

9. Nanoesferas de ésteres alquílicos del ácido poli(?-glutámico) según reivindicación 1, caracterizadas porque para una carga de a-quimotripsina del 100% w/w presentan una capacidad de encapsulación del 3 al 18% w/w, siendo la liberación total de a-quimotripsina entre 15 y 40 días en condiciones fisiológicas, con un perfil sigmoidal muy conveniente para su aplicación biomédica.