NANOCRISTALES SOLUBLES EN AGUA NO ISOTOPICOS ULTRASENSIBLES.

Nanocristal semiconductor soluble en agua que comprende un núcleo y una envuelta semiconductores así como una cubierta de uno o más compuestos adicionales que comprenden agentes de solubilización en agua,

caracterizado porque el agente de solubilización en agua se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxamatos o derivados del ácido hidroxámico o una combinación de los mismos

Nanocristales solubles en agua no isotópicos ultrasensibles.

La presente invención se refiere a nanocristales solubles en agua no isotópicos ultrasensibles para su utilización en sistemas de detección no isotópicos especialmente como sondas para aplicaciones biológicas en las que las sondas pueden proporcionar una señal de resonancia paramagnética electrónica (RPE) o una señal de fluorescencia o combinación de las mismas en respuesta a la exposición a radiación electromagnética.

Los sistemas de detección no isotópicos se han convertido en un modo preferido en vez de la utilización de marcadores radiactivos en la investigación científica y el diagnóstico clínico para la detección de biomoléculas utilizando diversos ensayos tales como secuenciación de ADN, amplificación de ácido nucleico, inmunohistoquímica, etc.

Los nanocristales semiconductores (puntos cuánticos) son útiles en aplicaciones biológicas puesto que pueden resultar solubles en agua, es decir, suficientemente solubles o que pueden suspenderse en una disolución de base acuosa tal como en agua o disoluciones a base de agua o disoluciones tampón incluyendo las utilizadas en sistemas de detección moleculares o biológicos.

En este contexto, el documento WO-A-0027365 propone una composición de nanocristales funcionalizados que comprende puntos cuánticos cubiertos con un compuesto de cobertura que comprende ácido mercaptocarboxílico que forma una primera capa y una segunda capa que comprende ácido diaminocarboxílico unido al compuesto de cobertura y capas adicionales que incluyen aminoácidos, o un ligando de afinidad unido al ácido diaminocarboxílico.

En el documento WO-A-00/58731, las nanopartículas resultan solubles en agua uniéndolas con un derivado de amino soluble en agua de un polisacárido.

Los documentos WO-A-00/28088 y WO-A-00/28089 describen nanocristales solubles en agua del tipo descrito en el documento WO-A-0027365 que presentan hebras de polinucleótidos para formar dendrímeros o nucleobases que pueden detectarse mediante emisión de fluorescencia.

El documento WO-A-00/17656 describe un nanocristal semiconductor soluble en agua que comprende como agente de solubilización SH(CH₂)_nX en el que X es carboxilato o sulfonato.

El documento WO-A-00/17655 describe un nanocristal semiconductor soluble en agua que comprende como agente de solubilización una molécula que presenta una zona hidrófoba y un grupo hidrófilo constituido por ácido carboxílico, carboxilato, sulfonato, hidróxido, alcóxidos, sales de amonio, fosfato, fosfonato, ácido metacrílico, ácido acrílico, estireno derivatizado de manera hidrófila, o moléculas que presentan la fórmula (R¹)_a-R²-(R³)_b(R⁴)_c]_d en la que R¹ se selecciona de entre el grupo constituido por heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, -OR, -SR, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O) R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(HR'R'')NR'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' y -P(S)OR en los que R, R' y R'' se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por H, un alquilo ramificado o no ramificado, un alquenilo ramificado o no ramificado, un heteroalquilo ramificado o no ramificado, un heteroalquenilo ramificado o no ramificado y un heteroalquinilo ramificado o no ramificado con la condición de que cuando a es mayor de 1, los grupos R' pueden ser iguales o diferentes o pueden unirse para formar un cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo heterocíclico, heteroarilo de seis, siete, ocho, nueve o diez miembros o un éter corona o éter heterocorona de seis a treinta miembros; R² se selecciona de un enlace, un alquileno ramificado o no ramificado, un heteroalquileno ramificado o no ramificado, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo heterocíclico y heteroarilo, R³ se selecciona de un alquileno ramificado o no ramificado, un alquenileno ramificado o no ramificado, un heteroalquileno ramificado o no ramificado, un heteroalquenileno ramificado o no ramificado, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo heterocíclico y heteroarilo, R⁴ se selecciona de entre el grupo constituido por un hidrógeno, un carboxilato, un tiocarboxilato, una amina, una amida, una imina, una hidrazina, un sulfonato, un sulfóxido, un fosfato, un fosfonato, un fosfonio, un alcohol, un tiol, un amonio, un alquilamonio, un nitrato, un resto azúcar y un cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo heterocíclico o heteroarilo de cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez miembros, siendo a 1, 2, 3 ó 4, siendo b 0, 1, 2 ó 3, siendo c 0, 1, 2 ó 3, siendo d 0, 1, 2 ó 3. El documento WO-A-00/17642 describe una composición que comprende nanocristales semiconductores fluorescentes asociados a un compuesto, proporcionando la emisión espectral de los nanocristales información sobre un acontecimiento o estado biológico, siendo los nanocristales solubles en agua debido a un ligando que presenta por lo menos un grupo de unión unido al nanocristal y un grupo hidrófilo.

El documento WO-A-00/29617 describe un punto cuántico luminiscente soluble en agua y un conjugado biomolecular del mismo para la detección no isotópica ultrasensible in vitro e in vivo. El punto cuántico luminiscente soluble en agua comprende un núcleo que consiste en un semiconductor de tamaño de nanopartícula (CdS o CdSe), una cubierta que consiste en un semiconductor que difiere del del núcleo (ZnS o CdS) y un grupo de unión hidrófilo que consiste en cualquier grupo orgánico que pueda unirse a la superficie de la cubierta y haga al punto cuántico soluble en agua. La unión entre la cubierta y el grupo de unión hidrófilo se realiza a través de un átomo de azufre.

El punto cuántico semiconductor luminiscente soluble en agua puede unirse entonces directa o indirectamente con una biomolécula como una proteína, un fragmento de proteína o un ácido nucleico, a través del grupo de unión hidrófilo.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un nanocristal soluble en agua preparado con nuevos agentes de solubilización y el procedimiento de solubilización en agua de los nanocristales. Se proporcionan también sondas de nanocristales semiconductores solubles en agua para aplicación biológica, pudiendo proporcionar las sondas una señal de fluorescencia o una señal de resonancia paramagnética electrónica (RPE) detectable o una combinación de las mismas en respuesta a la exposición a radiación electromagnética.

El nanocristal semiconductor soluble en agua según la invención comprende un núcleo y una envuelta semiconductores así como una cubierta de uno o más compuestos adicionales que comprenden agentes de solubilización en agua, y se caracteriza porque el agente de solubilización en agua se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxamatos o derivados de ácido hidroxámico o una combinación de los mismos.

El núcleo es una nanopartícula semiconductora. Aunque puede utilizarse cualquier núcleo de los semiconductores IIA-VIB, IIIA-VB o IVA-VIB, el núcleo debe ser tal que resulte un punto cuántico luminiscente tras su combinación con una envuelta. El núcleo es preferentemente CdSe o ZnSe.

La envuelta es un semiconductor que difiere del del núcleo y se une al núcleo y es preferentemente un semiconductor IIA-VIB de un hueco de banda superior al hueco de banda del núcleo, preferentemente ZnS, CdS o ZnSe.

Según una forma de realización de la invención, el agente de solubilización en agua es hidroxamato o un derivado de ácido hidroxámico o una combinación de los mismos.

Por consiguiente, se disuelve polvo de nanocristal en un disolvente alifático y entonces se mezcla con una disolución en agua de derivado de ácido hidroxámico, se extrae la capa alifática que contiene los nanocristales y se precipitan los nanocristales mediante la adición de un disolvente alcohólico, secándose entonces el precipitado para dar un polvo o disolviéndose en agua.

Preferentemente, el nanocristal según la invención está dopado con iones paramagnéticos, tales como Mn²+ y otros iones de transición o tierras raras.

La invención también proporciona una sonda de nanocristales solubles en agua que comprende un nanocristal semiconductor, un agente de solubilización en agua, un agente de unión y un resto de afinidad que puede unirse específicamente a sustancias biológicas detectables, caracterizada porque el nanocristal soluble en agua es según la reivindicación...

1. Nanocristal semiconductor soluble en agua que comprende un núcleo y una envuelta semiconductores así como una cubierta de uno o más compuestos adicionales que comprenden agentes de solubilización en agua, caracterizado porque el agente de solubilización en agua se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxamatos o derivados del ácido hidroxámico o una combinación de los mismos.

2. Nanocristal semiconductor soluble en agua según la reivindicación 1, caracterizado porque el nanocristal está dopado con iones paramagnéticos.

3. Sonda de nanocristales solubles en agua que comprende un nanocristal semiconductor soluble en agua según la reivindicación 1, un agente de solubilización en agua, un agente de unión y un resto de afinidad que puede unirse específicamente a las sustancias biológicas detectables.

4. Sonda según la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de unión puede conectar el nanocristal soluble en agua o la perla polimérica que comprende uno o más nanocristales incrustados en la misma, con las moléculas de afinidad incluyendo péptidos, proteínas, anticuerpos monoclonales o policlonales y sus fragmentos funcionales, oligonucleótidos, ARN, ADN mono- y bicatenario, moléculas himéricas ARN-ADN, tríplex y múltiplex de ADN e hidratos de carbono que pueden unirse específicamente a las sustancias biológicas detectables.

5. Sonda según las reivindicaciones 3 y 4, caracterizada porque el agente de solubilización en agua es asimismo el agente de unión.

6. Procedimiento para la preparación de un nanocristal semiconductor soluble en agua según la reivindicación 1, caracterizado porque se disuelve un polvo de nanocristal en un disolvente alifático y se mezcla a continuación con una disolución de agua de derivado de ácido hidroxámico, se extrae la capa alifática que contiene los nanocristales, y se precipitan los nanocristales mediante la adición de un disolvente alcohólico, secándose a continuación el precipitado para proporcionar un polvo o ser disuelto en agua.

7. Procedimiento de detección de sustancias biológicas mediante el registro de la señal de RPE a partir de iones paramagnéticos incorporados a los nanocristales según la reivindicación 2.

8. Procedimiento de detección de sustancias biológicas mediante el registro de la señal de fluorescencia a partir del nanocristal según la reivindicación 1 ó 2.

9. Procedimiento de detección de sustancias biológicas mediante el registro de una combinación de señal de fluorescencia y señal de RPE a partir de iones paramagnéticos incorporados a los nanocristales según la reivindicación 2.

10. Procedimiento de detección de sustancias biológicas mediante la construcción de imágenes de sustancias biológicas mediante microscopía de RPE o fluorescencia o una combinación de las mismas a partir de los nanocristales según la reivindicación 1 ó 2.