Micro y nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli (beta,

L-málico).

Micro y nanoesferas constituidas por ácido poli(beta, L-málico) de biosíntesis metilado al 100% o al 75%, ambos polímeros insolubles en agua. Las partículas se obtienen, de forma controlable y reproducible, por los métodos de emulsión/evaporación o diálisis. Son hidrolizables en condiciones fisiológicas y permiten la encapsulación homogénea de principios activos, tales como fármacos o proteínas, produciéndose la liberación completa de los mismos en el rango de días

Micro y nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico).

Sector de la técnica

Química.

Objeto de la invención

Partículas de tamaño micro y nanométrico fabricadas con ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) de biosíntesis de utilidad para el encapsulamiento de fármacos. El método de obtención es reproducible, obteniéndose partículas esféricas en las que el agente terapéutico se distribuye de forma homogénea. Para estas partículas se prevén interesantes aplicaciones biomédicas en la liberación controlada de fármacos.

Antecedentes

Las micro y nanopartículas biodegradables son sistemas de gran interés por sus aplicaciones biomédicas como dispensadores de compuestos bioactivos terapéuticos ya sea de bajo peso molecular o macromoleculares. (Panyam, J., Labhasetwar, V., Adv. Drug Del. Rev., 55, 329,2003). Diversos polímeros, tanto sintéticos como naturales, han sido utilizados en la preparación de sistemas de liberación controlada de fármacos, entre estos se encuentran los poliésteres que son susceptibles de hidrolizarse tras ser implantados en el cuerpo. Los poliésteres alifáticos biodegradables como el ácido poli(láctico) (PLA), el ácido poli(glicólico) (PGA), la poli(varepsilon-caprolactona) (PCL) y sus co-polímeros han sido ampliamente utilizados (Lemoine et al. Biomaterials, 17, 2191,1996). Sin embargo, son necesarias nuevas formulaciones tecnológicas capaces de producir partículas micrométricas y submicrométricas biodegradables y biocompatibles.

El ácido poli(ß,L-málico) (PMLA) es un poliéster que puede obtenerse por fermentación biológica (Lee, B.S., Biopolymers, Vol. 3, Polyesters I, Doi, Y., Steinbuechel, A., Eds., Wiley-VCH, Weinheim 2002). Es soluble en agua, biodegradable, y biocompatible, es decir, que se metaboliza en productos no tóxicos para el organismo. La esterificación de su grupo carboxilo lateral conduce a la obtención de polímeros no solubles en agua con propiedades radicalmente diferentes a las del biopolímero de partida (Fernández et al. Polymer, 47, 6501, 2006). Los esteres metílicos, formalmente llamados poli(a-metil ß,L-malato)s, pueden estar metilados totalmente, PAALM-1(100), o con grados de metilación parcial, n, coPAALM-1(n). Mediante el grado de metilación es posible controlar fácilmente la hidrofobia del polimalato resultante. El PAALM-(100) y el coPAALM-1(75) son insolubles en agua. Para estos poli(a-metil ß,L-malato)s se prevén interesantes aplicaciones biomédicas en el campo de la encapsulación y la liberación controlada de fármacos. En concreto, copolímeros anfifílicos o polímeros hidrofóbicamente modificados están siendo ampliamente investigados en el campo de la biotecnología y la farmacología. Dichos sistemas bajo condiciones adecuadas tienden a constituir estructuras que protegen los agentes terapéuticos de la degradación enzimática, especialmente en el caso de proteínas y péptidos (Takami et al. J. Biomater. Sci., Polymer Edn. 17, 875, 2006). Diferentes estudios demuestran que los métodos de emulsión/evaporación permiten controlar los tamaños de las partículas poliméricas en el rango nano o micrométrico (Freitas et al. J. Control. Release 102, 313, 2005; O'Donell, P.B., McGinity, J.W., Adv. Drug Del. Rev., 28, 25, 1997). Sin embargo según el dispositivo en concreto, deben seleccionarse cuidadosamente las condiciones de encapsulación para que se garantice la homogeneidad de la partícula y para que la eficiencia del agente terapéutico sea adecuada.

Descripción del invento

Preparación

Las microesferas de PAALM-1(100) (Figura 1 izquierda) se obtienen mediante el método de emulsión/evaporación. Las nanoesferas de coPAALM-1(75) (Figura 1 derecha) se preparan por el método de diálisis. Se ha constatado la reproducibilidad en la obtención de estos nuevos dispositivos, así como, la eficiencia en la micro y nanoencapsulación de compuestos y su posterior liberación controlada. En concreto, la presente invención se refiere a la microencapsulación de eritromicina en PAALM-1(100) y a la nanoencapsulación de proteínas en coPAALM-1(75).

Materiales

El PMLA de partida se obtiene vía cultivo de Physarum polycephalum según el método ya descrito (Fischer et. al., Biochemistry, 28, 5219, 1989; Holler et al., FEMS Microbiology Reviews, 103, 109, 1992; Holler, Handbook of Engineering Polymeric Materials, N.P. Cheremisinoff, (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York 93, 1997; Lee et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 415, 1999; Lee y Holler, FEMS Microbiol. Lett., 193, 69, 2000). La metilación del PMLA con diazometano (Fernández, C. E. et. al., Polymer, 47, 6501, 2006) en la proporción adecuada, permite obtener los correspondientes copolimalatos.

La eritromicina, ensayo 95%, fue suministrada por Fluka, la lipasa de Candida cylindracea (EC 3.1.1.3, Tipo VII, 943 unidades mg^-1) y la a-quimotripsina de páncreas bovino (EC 3.421.1, Tipo II, 50 unidades mg^-1) fueron suministrados por Sigma. Se utilizaron solventes orgánicos de grado analítico y se emplearon sin mas purificación. El agua utilizada en la preparación de las soluciones amortiguadoras fue desionizada en un equipo "Milli-Q".

Lipasa de Candida cylindracea (1310 unidades mg^-1), albúmina de suero bovino (BSA), ß-lactoglobulina, de leche bovina, mioglobina de corazón de caballo, Citocromo-c de corazón bovino, fueron suministrados por Sigma. a-Quimotripsina de páncreas bovino (55 unidades mg^-1) y lisozima de huevo blanco de gallina fueron suministrados por Fluka. N,N'-Diisopropilcarbodiimida 99% (carbodiimida hidrosoluble, WSC) fue suministrada por Aldrich.

Procedimiento general de preparación

• Obtención de los esteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico)

Se añade una solución de diazometano en éter en la proporción adecuada según sea el grado de metilación seleccionado, a una disolución de ácido poli(ß,L-málico) de biosíntesis, de peso molecular M_w 26.000 y M_w/M_n = 1,25, en acetona anhidra y se agita la muestra a temperatura ambiente durante 1 h. Se evapora el solvente a presión reducida obteniéndose el compuesto metilado como un polvo blanco, el cual se disuelve en N-metilpirrolidona (NMP) y se precipita en éter dietílico frío. Dicho polímero se filtra, se lava con éter frío, y se seca a presión reducida. En la Tabla 1 se indican las características de PAALM-1(100) y coPAALM-1(75) utilizados en la preparación de micro y nanoesferas respectivamente, así como del PMLA de partida.

• Preparación de microesferas

Las microesferas de PAALM-1(100) se forman por el método de emulsión y evaporación del solvente. Se solubiliza el fármaco en una disolución previamente obtenida de PAALM-1(100) en un solvente orgánico adecuado. La solución orgánica se mezcla con otra disolución acuosa de alcohol polivinílico (4, 6, 8 y 10%) empleado como emulsificante y mediante agitación (400, 800, 1200 y 1600 rpm) a temperatura ambiente durante 4 h. Tras la evaporación completa de los solventes se obtienen las microesferas, cuya formación se sigue en un microscopio óptico de polarización Olympus BX51 equipado con un sistema de cámara digital. Las microesferas se suspenden en agua destilada y se recuperan por liofilización. La morfología se estudió realizando micrografías de SEM en un instrumento JEOL SSM-6400. Mediante dispersión láser/PIDS, usando un Beckman Coulter LS 1332, se midió la distribución de tamaño de partícula. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se determina el contenido de fármaco mediante espectroscopia de UV-visible. La eficiencia en la encapsulación de eritromicina es del 90% para un contenido de fármaco del 30% en peso.

El fármaco se distribuye homogéneamente en la matriz de polímero tal como indican los estudios de calorimetría diferencial de barrido, realizados en un calorímetro DSC Perkin-Elmer Pyris calibrado con indio. La espectroscopia UV-visible realizada con un espectrómetro Cecil CE2021, ha revelado que las microesferas presentan, en condiciones fisiológicas, un perfil adecuado de liberación de fármaco frente al tiempo, tal como se muestra en la Figura 3. En concreto, para un porcentaje...

1. Micro y nanoesferas caracterizadas por estar constituidas por ésteres metílicos derivados del ácido poli(ß,L-málico) de origen natural con un rango de metilación entre el 75 y el 100%, las cuales son degradables hidrolíticamente en condiciones fisiológicas, permiten la encapsulación tanto de moléculas de bajo peso molecular como de macromoléculas y son susceptibles de modular su hidrodegradabilidad en función de la proporción de grupos éster metílicos en la matriz polimérica.

2. Microesferas del éster metílico del ácido poli(ß,L-málico) con un porcentaje de metilación del 100% según reivindicación 1, caracterizadas por obtenerse espontáneamente por el método de emulsión/evaporación.

3. Nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) con un porcentaje de metilación alrededor del 75% según reivindicación 1, caracterizadas por obtenerse espontáneamente por el método de diálisis.

4. Micro y nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) según reivindicación 1, caracterizadas por obtenerse de forma controlable y reproducible mediante ajuste de la temperatura, la concentración de polímero, la velocidad de agitación y la concentración de emulsificante.

5. Micro y nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) según reivindicación 1, caracterizadas por constituir sistemas homogéneos cuando se asocian con agentes terapéuticos.

6. Microesferas del éster metílico del ácido poli(ß,L-málico) con un porcentaje de metilación del 100% según reivindicación 1 caracterizadas porque para una carga de eritromicina del 30% en peso presentan una capacidad de encapsulación próxima al 90%, con liberación total a los diez días en condiciones fisiológicas.

7. Nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) con un porcentaje de metilación alrededor del 75% según reivindicación 1, caracterizadas porque inmovilizan cantidades de proteína entre el 10 y el 30%, proporcional al punto isoeléctrico (pI).

8. Nanoesferas de ésteres metílicos del ácido poli(ß,L-málico) con un porcentaje de metilación alrededor del 75% según reivindicación 1, caracterizadas porque la liberación de proteína inmovilizada se completa en un periodo de 3-4 días bajo condiciones fisiológicas, con una retención de la actividad cercana al 80% en el caso de enzimas.