"Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el núcleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre cualquier tipo de soporte".

El procedimiento consiste en utilizar una mezcla de colorantes fluorescentes que contiene un colorante para el núcleo celular y otro para el citoplasma de forma que, entre otras aplicaciones, sea posible la observación, con microscopia de epifluorescencia, de cultivos celulares realizados sobre soportes opacos y transparentes

Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el núcleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre cualquier tipo de soporte.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector de los colorantes, en relación con las Ciencias Biológicas, Médicas y Veterinarias. Concretamente es un procedimiento sencillo que utiliza mezclas de colorantes para el estudio, mediante microscopia de fluorescencia, de la morfología general de las células en cultivo en diferentes tipos de soporte incluyendo los soportes opacos.

Estado de la técnica anterior

La microscopia de fluorescencia es una de las metodologías fundamentales en Biología Celular permitiendo el estudio de organelas y moléculas celulares mediante, por ejemplo, los métodos inmunocitoquímicos o la detección de secuencias concretas de ácidos nucleicos mediante la hibridación "in situ" fluorescente. El desarrollo de la terapia celular y de la ingeniería tisular ha favorecido la utilización de una gran variedad de andamiajes y soportes sobre los que se cultivan diferentes tipos celulares. Algunos de estos soportes son opacos, por ejemplo, láminas de fibrina (Brown R.A., Phillips J.B., 2007. Int Rev Cytol 262, 75-150), polímeros biocompatibles (Sun T., Norton D., Ryan A.J., MacNeil S., Haycock J.W., 2007. J Mater Sci Mater Med 18, 321-328), materiales cerámicos (Marcacci M., Kon E., Moukhachev V., Lavroukov A., Kutepov S., Quarto R., Mastrogia como M., Cancedda R., 2007. Tissue Eng 13, 947-955) e incluso metales como el titanio (Maeda M., Hirose M., Ohgushi H., Kirita T., 2007. J Biochem (Tokyo) 141, 729-736).

Independientemente del estudio concreto que se realice suele ser necesario un estudio morfológico general de las células en cultivo. Cuando los soportes sobre los que se cultivan las células son transparentes, este estudio se realiza con luz transmitida y microscopia de contraste de fase, contraste interferencial o con microscopia de campo claro. En este último caso, previamente las células se tiñen con métodos generales tales como hematoxilinaeosina, Giemsa, etc. Cuando los soportes no son transparentes es necesario utilizar epi- iluminación, como generalmente se hace en microscopia de fluorescencia, por lo que sería muy útil disponer de un método sencillo de coloración general, que permitiera el estudio de la morfología citoplásmica y nuclear en estos cultivos celulares mediante tinciones flourescentes.

El núcleo celular se tiñe tanto para citometría de flujo como para microscopia de fluorescencia con sustancias que se unen a las cadenas de DNA como, entre otras, el 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Krishan A., Dandekar P.D., 2005. J Histochem Cytochem, 53; 1033-1036) y algunos derivados de la cianina (TOTO, YOYO) , del benzimidazol (Hoechst 33258, Hoechst 33342) (Adhikary A., Buschmann V., Muller C., Sauer M., 2003. Nucleic Acids Res 31, 2178-2186), naranja de acridina o bromuro de etidio.

Para el estudio de los citoplasmas celulares suelen utilizarse métodos inmunocitoquímicos específicos, mediante inmunofluorescencia indirecta, para detectar elementos citoplásmicos muy abundantes como son los componentes del citoesqueleto, por ejemplo, tubulina o actina. Estos métodos de inmunofluorescencia son laboriosos y costosos.

Sería conveniente poseer un método sencillo y económico que permitiera el estudio morfológico general del núcleo y citoplasma de células en cultivo que pueda utilizarse para todo tipo de soportes incluyendo los soportes opacos.

Breve descripción de la invención

La presente invención consiste en una mezcla de colorantes fluorescentes que tiñen de forma rápida y simple de manera el núcleo y el citoplasma celular permitiendo el estudio con microscopia de fluorescencia de cultivos celulares realizados tanto sobre soportes transparentes como sobre soportes opacos.

La mezcla de colorantes consiste:

La mezcla puede prepararse concentrada y diluirse en el momento de su utilización.

Descripción detallada de la invención

Consideramos conveniente disponer de una mezcla colorante que de forma sencilla y eficaz permita el estudio de la morfología general del núcleo y del citoplasma de las células en cultivo, sobre todo de las células cultivadas sobre soportes opacos que no permiten los estudios microscópicos con luz transmitida.

La presente invención es una mezcla que contiene dos colorantes fluorescentes, uno para el núcleo y otro para el citoplasma, un solvente y un estabilizador.

Como colorante nuclear pueden ser utilizados colorantes fluorescentes tales como los derivados del fenilindol (DAPI), algunos derivados de la cianina (TOTO, YO-PRO, TO-PRO) o del benzimidazol (Hoechst 33258, Hoechst 33342) o el yoduro de propidio,bromuro de etidio o naranja de acridina.

Como colorante citoplásmico podemos utilizar derivados de la fluoresceína como la eosina amarilla, la eosina azulada, el diacetato de fluoresceína, derivados del triarilmetano (fucsina ácida, verde luz), o derivados azoicos (azul de Evans).

Como solvente, además de agua destilada o purificada utilizamos preferentemente alcohol metílico o etílico, que también tienen capacidad de preservar la disolución.

Como ejemplo de realización podemos preparar la siguiente disolución concentrada:

- Disolver en 50 ml de agua destilada:

- Añadir 50 ml de etanol absoluto.

Para obtener a disolución de trabajo se diluye la disolución concentrada 1 a 10 con agua destilada.

Este tipo de mezclas colorantes fluorescentes, además de ser específicamente útiles en cultivos celulares sobre soportes opacos son también utilizables en cultivos celulares sobre soportes transparentes y pueden serlo también en secciones histológicas de órganos y tejidos.

En los equipos, tanto de microscopia láser confocal como de fluorescencia convencional, que dispongan de luz ultravioleta, los citoplasmas celulares teñidos con eosina (máximo de absorción a 542 nm) muestran fluorescencia roja (545 nm)y los núcleos teñidos con DAPI (máximo de de absorción a 359 nm) muestran color azul (461 nm). En los equipos que carezcan de luz ultravioleta los núcleos se observan de color rojo.

Aunque la mayor sencillez y utilidad se puede obtener con la mezclas colorantes descritas pueden obtenerse resultados similares mediante tinción secuencial primero con el colorante citoplásmico y luego con el colorante nuclear.

Un experto en la materia podría introducir cambios o modificaciones en los ejemplos de realización descritos sin salirse de esta invención según está definido en las reivindicaciones adjuntas.

1. Mezcla de colorantes fluorescentes para teñir el núcleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre cualquier tipo de soporte caracterizado porque contiene:

2. Mezcla de colorantes fluorescentes, según reivindicación 1 caracterizada porque es válida para teñir células cultivadas sobre soportes opacos, transparentes y secciones histológicas de órganos y tejidos.

3. Mezcla de colorantes según la reivindicación 1 que contiene como colorante nuclear DAPI disuelto en agua destilada, en una concentración superior a 0,1 mg/l; un colorante citoplásmico, eosina amarilla disuelta en agua destilada en una concentración superior a 10 mg/l; un estabilizante, glicina disuelta en agua destilada y un preservante, etanol.

4. Procedimiento para teñir el núcleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre cualquier tipo de soporte caracterizado porque se realiza de forma secuencial tiñéndose primero el citoplasma de las células y después el núcleo.