Método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato (MXTPG) en un extracto celular,

caracterizado por:

(a) la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución para resolver al menos un MTXPG; (b) irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto; y (c) detectar dicho al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, determinando de ese modo el nivel de dicho MTXPG, en el que la detección de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto se produce sin fraccionamiento de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto a partir de otras especies de MTXPG

Métodos para la detección directa de metabolitos de metotrexato individuales.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a métodos para monitorizar el tratamiento con fármacos y, más específicamente, a métodos para monitorizar la eficacia y la toxicidad del tratamiento farmacológico con metotrexato.

Antecedentes de la invención

El folato (ácido fólico) es una vitamina que es esencial para los procesos que mantienen la vida de síntesis, replicación y reparación de ADN. El folato también es importante para la biosíntesis de proteínas, otro proceso que es fundamental para la viabilidad de las células. El compuesto de pteridina, metotrexato (MTX), es estructuralmente similar al folato y como resultado puede unirse a los sitios activos de una serie de enzimas que normalmente usan folato como coenzima para la biosíntesis de precursores de nucleótidos de purina y pirimidina del ADN y para la interconversión de aminoácidos durante la biosíntesis de proteínas. A pesar de su similitud estructural con el ácido fólico, el metotrexato no puede usarse como cofactor por las enzimas que requieren folato, y en su lugar compite con el cofactor folato por los sitios de unión a enzimas, inhibiendo de este modo la biosíntesis de proteínas y ADN y, por tanto, la división celular.

La capacidad del metotrexato para inhibir la división celular se ha aprovechado en el tratamiento de una serie de enfermedades y estados que se caracterizan por un crecimiento celular rápido o aberrante. Como ejemplo, las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por una respuesta inmunitaria inapropiada dirigida contra los tejidos autólogos (propios) normales y están mediadas por células B o células T que se replican rápidamente. Las enfermedades autoinmunitarias que se han tratado con metotrexato incluyen, sin limitación, artritis reumatoide y otras formas de artritis, psoriasis, esclerosis múltiple, la fase autoinmunitaria de la diabetes mellitus (diabetes tipo 1 o de aparición juvenil), uveorretinitis autoinmunitaria, miastenia grave, tiroiditis autoinmunitaria y lupus eritematoso sistémico.

Puesto que muchas células malignas proliferan más rápidamente que las células normales, el metotrexato también puede usarse para afectar de manera selectiva al crecimiento de células cancerosas. Como consecuencia, el metotrexato es un agente antineoplásico usado ampliamente, empleado, por ejemplo, en el tratamiento de leucemia linfocítica aguda, cáncer de mama, cánceres epidermoides de cabeza y cuello, micosis fungoide avanzada, cáncer de pulmón, linfomas no de Hodgkins, coriocarcinoma gestacional, mola invasiva y molas hidatiformes.

A pesar de su eficacia terapéutica para una amplia variedad de enfermedades y estados, el tratamiento con metotrexato puede presentar un riesgo para el paciente. En particular, dado que el metotrexato interfiere en los procesos requeridos para la replicación y división de células normales así como enfermas, niveles inapropiadamente altos del fármaco pueden conducir a la destrucción de tejidos no diana que proliferan activamente tales como la médula ósea y la mucosa intestinal. Se ha asociado al metotrexato con la toxicidad renal y hepática cuando se administra en el régimen de dosis altas que se requiere para algunos estados. Además, el tratamiento con metotrexato a dosis bajas puede conducir a toxicidad y efectos secundarios no deseados en algunos pacientes, cuando la dosificación no es apropiada debido a la variabilidad individual en los parámetros farmacocinéticos que influyen, por ejemplo, en la absorción, selección como diana y aclaramiento del fármaco. Esta situación es especialmente problemática en el tratamiento de estados crónicos tales como la artritis reumatoide, en la que el metotrexato puede administrarse durante un periodo de muchos años.

Puesto que las diferencias individuales en los parámetros farmacocinéticos pueden ser difíciles de predecir, las estrategias seguras y eficaces de tratamiento con metotrexato requieren que se monitoricen los niveles de metotrexato o metabolitos de metotrexato en los pacientes en tratamiento. Se han desarrollado una variedad de métodos para monitorizar las concentraciones farmacológicas de metotrexato en plasma que incluyen bioensayos, ensayos cromatográficos y de detección inmunológicos. Tales métodos de detección en plasma han sido útiles para monitorizar el tratamiento con metotrexato a dosis altas en algunas aplicaciones clínicas. Sin embargo, debido a las limitaciones en su sensibilidad, estos métodos de detección en plasma no han sido útiles para monitorizar el tratamiento con metotrexato a dosis bajas, para el que deben analizarse los niveles intracelulares de los metabolitos de metotrexato.

El metotrexato se metaboliza tras la captación por las células de mamífero, de manera que se añaden uno o más restos de glutamilo al metotrexato dando una mezcla de poliglutamatos de metotrexato (MTXPG). El número de restos de glutamilo que pueden añadirse al MTX generalmente varía de dos a siete. Los MTXPG no se liberan fácilmente de las células y por tanto pueden ejercer sus efectos citotóxicos durante largos periodos de tiempo. Se ha demostrado que los niveles de MTXPG intracelulares son mayores en pacientes que respondieron al tratamiento con metotrexato en comparación con los niveles intracelulares en pacientes que no respondieron. Los métodos disponibles actualmente para medir los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato se basan en un ensayo con la enzima dihidrofolato reductasa en el que los niveles de poliglutamatos de metotrexato se calculan basándose en su capacidad para inhibir a la enzima dihidrofolato reductasa. Sin embargo, el alcance de la inhibición de la enzima en estos ensayos depende del número de restos de glutamilo unidos al metotrexato, haciendo imposible una determinación exacta de los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato mediante este método. La variabilidad de los ensayos basados en la hidrofolato reductasa puede agravarse además en algunas situaciones porque los folatos, que están presentes en diferentes cantidades dependiendo de la respuesta de un individuo al tratamiento con metotrexato y la cantidad de folato aportada por la dieta, también influyen en los resultados del ensayo actual con la enzima.

La publicación PCT número WO 2004/020622 describe un método para determinar de manera indirecta los niveles de MTXPG convirtiendo en primer lugar los MTXPG en MTX y cuantificando después los niveles de MTX, en el que los niveles cuantificados de MTX se correlacionan con los niveles de MTXPG.

Brouwer et al. (FASEB J., 14:A720 (2000)) describe un método para cuantificar los niveles de MTXPG usando el fraccionamiento de los MTXPG de glóbulos rojos (GR). El método no detecta los MTXPG de GR en una única ejecución, sino que requiere dos etapas de separación en columna: (1) separación para elución total de las especies de MTXPG mediante cromatografía de afinidad, seguida por (2) otra separación para fraccionar y recoger los MTXPG en un único tubo antes de la fotólisis.

Por tanto, existe una necesidad de nuevos métodos para determinar los niveles intracelulares de poliglutamatos de metotrexato y para monitorizar la eficacia y la toxicidad del tratamiento con metotrexato incluyendo el tratamiento con metotrexato a dosis bajas. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato en un extracto celular caracterizado por la precipitación de material proteínico en el extracto celular y la inyección directa del sobrenadante resultante en un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para resolver al menos un MTXPG en el extracto celular; irradiar el al menos un MTXPG, produciendo de ese modo al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto; y detectar el al menos un producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto, determinando de ese modo un nivel del MTXPG. Un método de la invención puede ser útil, por ejemplo, para determinar un nivel de MTXPG₃, MTXPG₄ o MTXPG₅, o para determinar un nivel de cada una de las especies de MTXPG₁ a MTXPG₇ presentes en el extracto celular.

El método de la invención puede usarse para optimizar la eficacia terapéutica o reducir la toxicidad asociada con el tratamiento con metotrexato administrado a un ser humano seleccionando un fármaco o una dosificación que...

1. Método para determinar un nivel de un poliglutamato de metotrexato (MXTPG) en un extracto celular, caracterizado por:

en el que la detección de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto se produce sin fraccionamiento de dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente resuelto a partir de otras especies de MTXPG.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha precipitación de material proteínico es precipitación con ácido perclórico.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía de líquidos de alta resolución se lleva a cabo en una columna de fase inversa.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía de líquidos de alta resolución se lleva a cabo en una columna de fase inversa C18 con un tampón acetato de amonio/acetonitrilo.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho producto fotolítico de MTXPG fluorescente tiene dos picos de excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm, incluyendo un pico de desde 240 nm hasta 300 nm, y un pico de desde 360 nm hasta 410 nm, y un pico de emisión en el intervalo de 440 nm a 520 nm.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende irradiar con UV dicho al menos un MTXPG resuelto.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha irradiación con UV utiliza radiación que tiene una longitud de onda en el intervalo de 225 nm a 275 nm.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha irradiación con UV utiliza radiación que tiene una longitud de onda de 254 nm.

9. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo irradiando dicho al menos un MTXPG resuelto en un disolvente que tiene del 0,05% al 1% de H₂O₂.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la etapa (b) se lleva a cabo irradiando dicho al menos un MTXPG resuelto en un disolvente que tiene del 0,1% al 0,3% de H₂O₂.

11. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende irradiar dicho al menos un MTXPG resuelto durante de 0,5 a 60 segundos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la etapa (b) comprende irradiar dicho al menos un MTXPG durante de 0,5 a 15 segundos.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 240 nm a 420 nm.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 240 nm a 300 nm.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación con radiación UV a 274 nm.

16. Método según la reivindicación 13, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación en el intervalo de 360 nm a 410 nm.

17. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión en el intervalo de 320 nm a 550 nm.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión en el intervalo de 440 nm a 500 nm.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 464 nm.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la etapa (c) comprende detectar la fluorescencia tras la excitación con radiación UV a 274 nm y a una longitud de onda de emisión de 464 nm.

21. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de células humanas.

22. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato.

23. Método según la reivindicación 1, en el que el dicho extracto celular es de un ser humano sometido a tratamiento con metotrexato a dosis bajas.

24. Método según la reivindicación 22 ó 23, que comprende seleccionar un fármaco o una dosificación que debe administrarse posteriormente a dicho ser humano basándose en dicho nivel de MTXPG.

25. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar un nivel de MTXPG₃, MTXPG₄ o MTXPG₅.

26. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar un nivel de cada uno de MTXPG₁ a MTXPG₇.

27. Método según la reivindicación 24, que comprende alterar una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

28. Método según la reivindicación 27, que comprende reducir una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

29. Método según la reivindicación 27, que comprende aumentar una dosificación de MTX administrada posteriormente a dicho ser humano.

30. Método según la reivindicación 24, que comprende alterar una dosis de ácido fólico, o un derivado del mismo, administrada posteriormente a un ser humano.

31. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de glóbulos rojos.

32. Método según la reivindicación 1, en el que dicho extracto celular es un extracto de leucocitos.

33. Método según la reivindicación 1, que puede detectar menos de 500 nmol de cada especie de MTXPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

34. Método según la reivindicación 1, que puede detectar menos de 50 nmol de cada especie de MXTPG individual por litro de glóbulos rojos empaquetados.

35. Método según la reivindicación 22 ó 23, en el que dicho ser humano tiene una enfermedad autoinmunitaria.

36. Método según la reivindicación 35, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis.

37. Método según la reivindicación 35, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, poliartritis, lupus eritematoso sistémico y psoriasis.

38. Método según la reivindicación 22 ó 23, en el que dicho ser humano tiene cáncer.

39. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende fluorimetría.

40. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende espectrofotometría

41. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende espectrometría de masas.