METODO PARA DETECTAR UNA DISFUNCION ENDOTELIAL.

Método para detectar una disfunción endotelial.

La presente invención se refiere a un método para detectar una disfunción endotelial en un paciente mediante la administración de desmopresina y la posterior determinación del nivel del factor de von Willebrand en una muestra aislada de suero o plasma

Método para detectar una disfunción endotelial.

La presente invención se refiere al uso de la desmopresina en un método de diagnóstico de la disfunción endotelial a través de la determinación del nivel del factor de von Willebrand.

Estado de la técnica anterior

El endotelio participa de forma importante en la conservación de la homeostasis vascular mediante la secreción y liberación de diversas sustancias vasoactivas (moléculas de adhesión, citoquinas, óxido nítrico, etc). Por este motivo, cuando existe una alteración en su estructura o función, el lecho vascular es incapaz de responder de forma fisiológica frente a diferentes noxas o estímulos que se producen en el organismo. La disfunción endotelial desencadenada por diversos factores, como por ejemplo la diabetes mellitus, representa la pérdida de esta capacidad del endotelio para modular el comportamiento fisiológico del lecho vascular y representa un estadio temprano de la aterosclerosis.

La disfunción endotelial puede ser evaluada clínicamente a través de mediciones de vasodilatación dependiente de endotelio, y también por marcadores plasmáticos como endotelina 1, factor von Willebrand, trombomodulina y moléculas de adhesión de monocitos. Sin embargo ninguno de ellos por sí solo logra reflejar la indemnidad de la función endotelial. Hasta ahora la evaluación más eficaz de la función endotelial se logra a través de la respuesta vasodilatadora a un estímulo farmacológico o mecánico. Entre los factores identificados como estimuladores de la función del endotelio se encuentran acetilcolina, sustancia P, serotonina, bradicinina y trombina, que actúan en relación a receptores de membrana adosados a sistemas de transducción de proteínas G. También el roce provocado por un aumento del flujo sanguíneo constituye un estímulo mecánico de la vasodilatación a través de la liberación de óxido nítrico. El marcador de lesión endotelial más estudiado ha sido el factor von Willebrand (fvW). Aproximadamente el 85% del fvW plasmático deriva del endotelio vascular y el 15% restante es de origen plaquetario (Mannucci PM. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18: 1359-62). En la célula endotelial, la mayor parte de fvW maduro y su propéptido (97 kDa) se almacena junto con otras moléculas (t-PA, P-selectina, IL-8, endotelina) en los denominados cuerpos de Weibel-Palade. Las principales funciones del fvW son las de actuar como proteína transportadora del factor VIII y como proteína adhesiva de matriz intersticial y de las plaquetas al subendotelio. Existen diversos estudios que han demostrado un incremento de los niveles plasmáticos basales de fvW en los pacientes diabéticos en comparación con los controles sanos, pero no existe acuerdo sobre si este aumento se produce sólo en presencia de complicaciones vasculares, o bien, puede detectarse incluso en estadios precoces. En cualquier caso, los niveles de fvW son mayores cuando existen complicaciones vasculares. Varios grupos han demostrado que los niveles elevados de este marcador guardan relación con la presencia y grado de retinopatía, nefropatía y neuropatía. Además, se ha demostrado que las concentraciones elevadas de fvW son un factor independiente predictor de mortalidad de origen cardiovascular, tanto en población diabética como no diabética (Jager A. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19: 3071-3078). Sin embargo, existe un gran solapamiento entre los valores de fvW detectados en la población sana y en la población diabética con disfunción endotelial, por lo que su determinación no tiene utilidad en la práctica clínica diaria.

La superficie de las células endoteliales está recubierta de receptores, que permiten al endotelio realizar múltiples funciones, que se encuentran en continua investigación. Por eso la disfunción endotelial es la responsable de numerosas enfermedades como la arteriosclerosis, la hipertensión arterial, la sepsis, la trombosis, la vasculitis, hemorragias, etc.

Actualmente se define la disfunción endotelial como la imposibilidad del vaso sanguíneo de aumentar su diámetro en respuesta a un estímulo conocido, ocasionado por una insuficiente generación de agentes vasodilatadores en el endotelio. En arterias sanas se observa dilatación dependiente del endotelio en respuesta a estímulos vasoactivos (isquemia, acetilcolina) mientras que en diferentes estados patológicos se ha demostrado ausencia de este efecto vasodilatador, o incluso un efecto constrictor, producto del predominio del efecto directo de acetilcolina sobre receptores muscarínicos del músculo liso subyacente.

La diabetes mellitus es una enfermedad muy prevalente (6-10% de la población española) y de enorme impacto socio-sanitario que vendrá condicionado fundamentalmente por las severas complicaciones que produce, tanto macroangiopáticas (cardiopatía isquémica, enfermedad cerebrovascular, arteriopatía periférica), como microangiopáticas (retinopatía, nefropatía, neuropatía). En la fisiopatología de todas estas complicaciones vasculares de la diabetes, la disfunción endotelial desempeña un papel de primera magnitud. Por lo tanto, no cabe duda que el desarrollo de técnicas que permitan cuantificar la disfunción endotelial, no sólo aportarán mayor conocimiento fisiopatológico de las complicaciones vasculares de la diabetes sino que permitirán identificarlas en estadios iniciales (subclínicos), es decir antes de que puedan demostrarse mediante métodos convencionales.

Para valorar la disfunción endotelial se han desarrollado técnicas invasivas y no invasivas como son la coronariografía con test de acetilcolina o la medición con eco-doppler de alta resolución de los cambios en el diámetro y flujo de la arteria braquial tras someterla a varios estímulos. No obstante, ambas pruebas precisan de un equipamiento específico y deben ser llevadas a cabo por expertos. En consecuencia, su coste económico es elevado y su uso se limita actualmente a la investigación clínica.

Por lo tanto, existe una necesidad de disponer de un método alternativo que permita detectar una disfunción endotelial en un sujeto.

Explicación de la invención

La solución propuesta por los inventores consiste en la utilización de la desmopresina para inducir un incremento plasmático del fvW y de este modo valorar, de manera específica, la presencia de disfunción endotelial debido a que la variación de los niveles plasmáticos de fvW después de la administración de desmopresina en un paciente afectado de tal disfunción es menor que la variación en el caso de que no exista dicha disfunción.

La desmopresina (1-desamino-8-D-arginina-vasopresina, DDAVP) es un análogo estructural de la hormona hipofisaria natural arginina vasopresina. La desmopresina se utiliza en el tratamiento terapéutico de hemorragias y prevención de hemorragias, en pacientes con hemofilia A leve y enfermedad de Von Willebrand (tipo I, cuya actividad coagulante del factor VIII sea superior al 5%) que responden positivamente a la dosis de prueba. En casos excepcionales también se pueden tratar manifestaciones moderadas de estas enfermedades.

La DDAVP estimula la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade de la célula endotelial actuando específicamente sobre los receptores V2 de la vasopresina (Kaufmamm JE. et al. J Clin Invest 2000; 106: 107-116). Estos receptores no se encuentran presentes en las plaquetas por lo que el incremento plasmático de fvW tras la estimulación con DDAVP es exclusivamente a expensas del endotelio vascular.

En trabajos realizados con sujetos afectos de la enfermedad de von Wilebrand se ha observado que tras la administración de DDAVP los niveles plasmáticos de fvW experimentan un rápido incremento de hasta 3-5 veces (Mannucci M. et al., Blood 1997; 90: 2515-2521).

La elevación en los niveles plasmáticos del factor VIII y del FvW ocurre no sólo en los pacientes con deficiencias, sino también en individuos sanos y en pacientes que ya tienen niveles altos de estos factores.

De manera general, cuando la desmopresina se administra por vía endovenosa los niveles máximos de fvW se consiguen entre los 30 y 60 minutos, mientras que cuando la administración es subcutánea o intranasal el pico máximo se logra entre los 90 y 120 minutos. Independientemente de este hecho, las tres vías de administración han demostrado ser igual de eficaces. También se puede administrar por vía oral, aunque los tiempos de respuesta son algo superiores.

Aún siendo conocido que el incremento plasmático de fvW tras la estimulación con desmopresina es exclusivamente...

1. Método para detectar una disfunción endotelial, que comprende:

a) administrar al paciente 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma;

b) obtener una muestra de suero y/o plasma del paciente;

c) medir el nivel del factor de von Willebrand en la muestra aislada obtenida en la etapa (b);

d) determinar la variación del nivel obtenido en la etapa (c) respecto a un valor basal obtenido a partir de una muestra recogida del paciente antes de la administración de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; y

e) comparar la variación determinada en la etapa (d) con la variación observada en un individuo sano, de manera que si existe una diferencia entre ambas variaciones será indicativo de una disfunción endotelial.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) se administra una cantidad de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma suficiente para producir un incremento de los niveles plasmáticos del factor de von Willebrand.

3. Método de acuerdo con la reivindicación anterior 2, caracterizado porque la cantidad administrada en la etapa (a) está comprendida entre 0,2 y 4 µg/Kg de peso.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque en la etapa (a) se administra el acetato de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque la 1-desamino-8-D-arginina vasopresina se administra por vía endovenosa, subcutánea, oral o intranasal.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque se administra 0,3 µg/Kg de peso de acetato de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina por vía subcutánea.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque los valores del factor de von Willebrand se miden mediante un ensayo inmunoabsorbente enzimático ELISA.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque la medición del nivel del factor de von Willebrand se lleva a cabo en un periodo de entre 10 y 240 minutos tras la administración de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la medición se lleva a cabo entre 90 y 120 minutos.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque la disfunción endotelial está relacionada con complicaciones microvasculares y/o macrovasculares relacionadas con la diabetes mellitus.

11. Método para identificar un agente para el tratamiento de la disfunción endotelial, que comprende llevar a cabo las etapas (a) - (e) según la reivindicación 1, y porque comprende además:

f) administrar simultánea o secuencialmente al paciente 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y el agente candidato a fármaco;

g) obtener una muestra de suero y/o plasma del paciente;

h) medir el nivel de factor de von Willebrand en la muestra aislada obtenida en la etapa (g);

i) determinar la variación del nivel obtenido en la etapa (h) respecto a un valor basal obtenido a partir de una muestra recogida antes de la administración de 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma;

j) comparar la variación determinada en la etapa (d) con la variación observada en la etapa (i), de manera que si la variación de la etapa (i) es mayor que la variación de la etapa (d), es indicativo de que el agente es candidato a fármaco para el tratamiento de dicha disfunción.

12. Uso de la 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para detectar una disfunción endotelial.

13. Kit que comprende medios para llevar a cabo el método de la reivindicación 1.

14. Kit de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende:

a) 1-desamino-8-D-arginina vasopresina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma;

b) medios para determinar el nivel del factor de von Willebrand en una muestra de suero y/o plasma;

c) instrucciones para llevar a cabo el análisis e interpretación de resultados.

15. Kit de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque el medio para determinar el nivel del factor de von Willebrand en la muestra es un inmunoensayo enzimático ELISA.