METODO PARA DETECTAR FOSFOLIPIDO PROCOAGULANTE.

Un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra humana,

comprendiendo dicho método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden:

(i) formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa;

(ii) poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla; y

(iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla

Método para detectar fosfolípido procoagulante.

Campo técnico

Esta invención se refiere a ensayos de coagulación sanguínea y, más particularmente, se refiere a un método mejorado para un marcador de trombosis y activación de plaquetas y un factor de riesgo trombótico potencial.

Técnica antecedente

Los fosfolípidos procoagulantes, incluyendo, por ejemplo, fosfolípidos aniónicos tales como fosfatidil serina, tienen un papel importante en el mecanismo de coagulación sanguínea. Los fosfolípidos procoagulantes son necesarios en la ruta de coagulación intrínseca para la conversión del factor X en Xa por los factores VIIIa y IXa, y también en la ruta común para escisión de protrombina en trombina por factor Xa. Forman parte del complejo activador de factor tisular. En mecanismos antitrombóticos están implicados en la activación de proteína C por el complejo de trombina/trombomodulina y en la destrucción del factor Va por proteína C activada.

Típicamente están presentes bajos niveles de fosfolípidos procoagulantes en la sangre de individuos sanos, probablemente como micropartículas derivadas de una diversidad de células, principalmente plaquetas, pero estos niveles aumentan cuando las plaquetas se activan, por ejemplo, en respuesta a una lesión y a la activación de la coagulación sanguínea, del complemento o de mecanismos inmunológicos. Las plaquetas in vitro expresan una actividad procoagulante máxima después de la congelación y descongelación o de la activación por colágeno/trombina o agentes de alteración de la membrana tales como ionóforos. La activación anormal de plaquetas in vivo se produce durante episodios trombóticos, embolia, septicemia, coagulación intravascular diseminada e infarto. Por el contrario, se produce una activación inadecuada de plaquetas en ciertos trastornos sanguíneos tales como enfermedad de von Willebrand y con diversas anomalías de plaquetas.

Pueden detectarse tradicionalmente fosfolípidos procoagulantes en una muestra de plasma sanguíneo de paciente mediante un ensayo de coagulación, por ejemplo, el ensayo de veneno de víbora de Russell (en lo sucesivo "RVVT"), aunque dichos ensayos se usan más convenientemente para diagnosticar el lupus anticoagulante. El veneno usado en el RVVT contiene metaloproteasas que activan específicamente los factores V y X. Después de la adición de veneno e iones de calcio, la coagulación se desarrolla con una dependencia casi absoluta de fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente. La cantidad de fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente se determina de acuerdo con el tiempo necesario para la mezcla de ensayo para formar fibrina y coagularse y, por lo tanto, cesar de fluir en un tubo o aumentar la turbidez óptica o bloquear un orificio o apertura. El tiempo de coagulación o tiempo necesario para que se forme un coágulo de fibrina puede sustituirse como un indicador de punto final en esta y en descripciones posteriores mediante un sustrato cromogénico que da un producto coloreado fácilmente detectable cuando actúa sobre él la enzima de coagulación principal, trombina.

Cuando se sospecha que un paciente tiene una deficiencia de un factor tal como Factor X, V, II o fibrinógeno insuficiente, o está recibiendo anticoagulantes, la muestra del paciente se mezcla típicamente con una muestra de plasma humano normal sin plaquetas con el fin de suministrar los factores en los que es deficiente la muestra. Este plasma humano normal sin plaquetas se conoce típicamente como "plasma de sustrato". El plasma de sustrato usado en estos ensayos es idealmente sin plaquetas ya que de otro modo la coagulación no dependería absolutamente del fosfolípido procoagulante contenido en la muestra del paciente.

En el RVVT y otros ensayos de coagulación, el plasma de sustrato se prepara habitualmente por centrifugación a alta velocidad y/o filtración. Una desventaja principal de este procedimiento es que es difícil controlar la reducción de fosfolípido procoagulante del plasma de sustrato. El plasma fresco es esencial y con frecuencia esto es poco práctico de obtener. Una vez que el plasma se ha congelado, las plaquetas contenidas en el mismo se activan y liberan el fosfolípido procoagulante. Por consiguiente, se limita la sensibilidad proporcionada por el RVVT y otros ensayos de coagulación para la detección de fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente y la capacidad para regular la especificidad de estos ensayos. Una desventaja adicional es que estos procesos no eliminan algunas micropartículas de plaquetas que pueden tener una flotabilidad neutra o pueden ser demasiado pequeñas para eliminarse por filtración.

Otra desventaja de los métodos actuales para la determinación de fosfolípido procoagulante es su sensibilidad a inhibidores de la coagulación, tales como anticuerpos. Estos anticuerpos aparecen frecuentemente en enfermedades autoinmunes, por ejemplo, "síndrome antifosfolipídico" y causan la prolongación de la mayoría de ensayos de coagulación que emplean reactivos que contienen fosfolípidos y, por lo tanto, dan resultados falsos negativos en los ensayos actuales para fosfolípidos procoagulantes.

Boffa M. C., 1980 (Thrombosis research 17, páginas 567-572, 1980) describe un método para evaluar la actividad procoagulante relacionada con fosfolípidos en una muestra de plasma de un paciente. Dicho método consiste simplemente en añadir sucesivamente a plasma centrifugado a alta velocidad (es decir, a un plasma con fosfolípido reducido preparado por centrifugación), una muestra de plasma de paciente a analizar y fosfolipasa de berus. Después de la adición de cloruro cálcico, se registra el tiempo de coagulación y se compara con el de los controles.

Boffa M. C., 1974 (Thrombosis research 4, Número de Suplemento 1, páginas 89-90, 1974) describe un método para determinar la actividad procoagulante de fosfolípidos en una muestra de sangre o plasma de un paciente, usando una fosfolipasa A2 como inhibidor de fosfolípidos específicos de veneno. Dicho método consiste en las siguientes etapas: (i) un plasma "normal" se trata con una fosfolipasa A2 aislada del veneno de Vipera berus; (ii) la muestra de plasma o sangre a analizar se añade al plasma tratado; (iii) el tiempo de recalcificación de la mezcla se registra y se compara con el de los controles.

Sumario de la invención

En vista del papel de fosfolípidos procoagulantes en la patogénesis de episodios trombóticos y su potencial como marcadores de la activación de plaquetas, existe la necesidad de un método mejorado para detectar la presencia de y la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra.

Por lo tanto, la presente solicitud describe un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra, comprendiendo el método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma de sustrato que se ha hecho liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, donde dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulación del plasma en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla, y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.

De acuerdo con un primer aspecto de esta invención se proporciona un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo el método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, donde dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa; (ii) poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.

La aplicación también describe un método de determinación de la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en una muestra, comprendiendo el método las etapas (i) a (iii) realizadas en el orden siguiente: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma de sustrato que...

1. Un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo dicho método las etapas (i) a (iii) realizadas en el siguiente orden:

        (i)        formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa;

        (ii)        poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones en las que el fosfolípido procoagulante es el componente limitante de velocidad de la mezcla; y

        (iii)        determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha sangre es sangre anticoagulada.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la medición se realiza en comparación con plasmas de referencia o soluciones que contienen cantidades conocidas de fosfolípido procoagulante y los valores desconocidos pueden interpolarse a partir de una curva de calibración construida apropiadamente.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho plasma de sustrato procede de sangre tratada con citrato.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho plasma de sustrato se obtiene de un miembro seleccionado del grupo de animales vertebrados que consiste en cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, visón, mapache, canguro y mezclas de los mismos.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho plasma de sustrato se obtiene de cerdos.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la fosfolipasa se obtiene del veneno seleccionado del grupo que consiste en Naja mossambica, Naja nigricollis, Agkistrodon halys, Vipera berus, Vipera russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina schistose, Oxyuranus scutellatus y Apis mellifera.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la fosfolipasa se obtiene de uno de un grupo seleccionado que consiste en Streptomyces violaceoruber, especies de Vibrio, Clostridium perfringens o Bacillus cereus.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el factor Xa procede de un mamífero distinto de un ser humano.

11. Un método para determinar la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en una muestra humana, comprendiendo dicho método las etapas (i) a (iv) realizadas en el siguiente orden:

        (i)        formar una mezcla de la muestra humana y un plasma de sustrato no humano que se ha liberado o liberado sustancialmente de suficiente fosfolípido procoagulante para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular, en la que dicho plasma de sustrato se ha liberado o liberado sustancialmente de fosfolípido procoagulante por tratamiento con una fosfolipasa;

        (ii)        poner en contacto la mezcla con factor Xa en condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla;

        (iii)        determinar el tiempo de coagulación de la mezcla; y

        (iv)        cuantificar la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas en la muestra.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho método determina si un paciente ha tenido un episodio trombótico reciente.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho método determina si un paciente ha tenido un trastorno clínico que implica activación de plaquetas.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el episodio trombótico se selecciona del grupo que consiste en coagulación intravascular diseminada, trombosis venosa profunda, embolia, traumatismo tisular, septicemia e infarto.

15. El método de la reivindicación 11, en el que la fosfolipasa se obtiene de veneno seleccionado del grupo que consiste en Naja mossambica, Naja nigricollis, Agkistrodon halys, Vipera berus, Vipera russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina schistose, Oxyuranus scutellatus y Apis mellifera.

16. El método de la reivindicación 11, en el que la fosfolipasa se obtiene de uno de un grupo seleccionado que consiste en Streptomyces violaceoruber, especies de Vibrio, Clostridium perfringens o Bacillus cereus.

17. El método de la reivindicación 11, en el que el factor Xa procede de un mamífero distinto de un ser humano.

18. El método de la reivindicación 11, en el que el plasma de sustrato se ha formado a partir de factores V y protrombina.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dichos factores V y protrombina están libres de fosfolípidos.

20. El método de la reivindicación 18, en el que dichos factores V y protrombina son de origen animal o humano.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en el que dicho plasma de sustrato se obtiene de un miembro seleccionado del grupo que consiste en cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, visón, mapache, canguro y mezclas de los mismos.

22. Un kit para determinar el nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra humana, comprendiendo dicho kit:

        (i)        un plasma de sustrato no humano que se ha tratado con una fosfolipasa para degradar suficiente fosfolípido para al menos reducir la capacidad del plasma de sustrato para coagular;

        (ii)        factor Xa; y

        (iii)        preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante.