Método para aumentar la monospermia en la fecundación in vitro.

La presente invención se refiere a un método para aumentar la eficacia de la fecundación in vitro de mamíferos induciendo el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos antes de su cocultivo con espermatozoides

Método para aumentar la monospermia en la fecundación in vitro.

Esta invención se refiere a un método para aumentar la eficacia de la fecundación in vitro de mamíferos mediante la reducción de los niveles de polispermia.

Estado de la técnica anterior

La polispermia en mamíferos es una anomalía de la fecundación resultante de la entrada de más de un espermatozoide en el citoplasma del ovocito (Hunter, 1991, Mol Reprod Dev. 29:385-391).

Esta patología se ha descrito en todas las especies de mamíferos en condiciones fisiológicas (coito, monta natural), pero en porcentajes muy bajos. Sin embargo, es más frecuente durante la fecundación in vitro (FIV), fundamentalmente en la especie porcina, aunque también ocurre con menor incidencia en otras como la bovina o la humana.

En la especie humana, la polispermia suele dar lugar a abortos espontáneos, aunque se han publicado referencias de nacimientos de niños triploides o tetraploides (Dean et al., 1997, J Med Genet 34:246-249; Roberts et al., 1996, Am J Med Genet 62:243-246; Sherard et al., 1986, Am J Med Genet 25:307-312; Shiono et al., 1988, Am J Med Genet 29:543-547; Uchida and Freeman, 1985, Am J Obstet Gynecol 151:65-69). Estos nacimientos poliploides se caracterizan por malformaciones severas y múltiples anormalidades (Doshi et al., 1983, Hum Pathol 14:716-723; Kjaer et al., 1997, Am J Med Genet 72:216-221; Pitt et al., 1981, J Med Genet 18:246-249).

En la mayoría de los casos en los mamíferos, el apareamiento tiene lugar antes de la ovulación y tras la fecundación se establece rápidamente una defensa contra la polispermia. Este bloqueo es estable y de larga duración (Hunter et al., 1998, J Exp Zool 280:182-188). Después de la penetración del espermatozoide, los gránulos corticales, unas organelas especializadas del ovocito, liberan su contenido al espacio perivitelino mediante un proceso conocido como reacción cortical. El contenido de los gránulos corticales altera las propiedades de la zona pelúcida, lo que se conoce como reacción de zona, y en consecuencia se bloquea la penetración polispérmica.

La zona pelúcida (ZP), es una matriz de glicoproteínas que sintetiza y segrega el ovocito en crecimiento y que juega un papel fundamental en los primeros momentos de la fertilización. La zona pelúcida está presente en los ovocitos de todos los mamíferos en el momento de la fecundación y desempeña unas funciones básicas en dicho proceso, tales como la unión del espermatozoide, la inducción de la reacción acrosómica, el bloqueo de la poliespermia y la protección frente a fecundaciones interespecíficas, además de desempeñar una función protectora del ovocito y del embrión temprano. La ZP es una cubierta glicoprotéica, espesa y elástica, que rodea al ovocito. En la ZP porcina se han identificado tres familias de glicoproteínas: ZP2, ZP3 y ZP4, con distintos pesos moleculares y diferente distribución. Estas glicoproteínas están altamente glicosiladas, lo que es muy importante para conferirle a la ZP sus funciones biológicas específicas. La composición y las características de la ZP parecen ser muy diferentes in vivo e in vitro, lo cual podría influir en la eficacia de la fecundación in vitro.

Entre los cambios que se han descrito en la zona pelúcida tras la fecundación y la reacción cortical, se encuentra el "endurecimiento" de la misma, medido mediante el aumento de su resistencia a la digestión con proteasas (Braden et al., 1954 Aust J Biol Sci 7:391-409; Austin y Braden, 1956 Journal of Experimental Biology 33:358-365; Barros y Yanagimachi, 1971, Nature 24; 233(5317):268-269; Drobins et al., 1988, J Exp Zool 245:206-219). Esta afirmación se basa en numerosos estudios realizados fundamentalmente en el ratón que demuestran una proteolisis selectiva de la glicoproteína de la zona pelúcida ZP2 por una proteasa de los gránulos corticales liberados tras la llegada del espermatozoide (Bleil et al., 1981, Dev Biol 86:189-197; Moller y Wassarman, 1989, Dev Biol 132:103-112). Este cambio en la zona pelúcida tendría como consecuencia la formación de puentes ditirosina o disulfuro, dependiendo de la especie, que en último término serían los responsables del endurecimiento (Schmell y Gulyas, 1980, Gamete Research 3:279-290; Zhang et al., 1991, Mol Reprod Dev 28:292-296) y por ende, del bloqueo de la polispermia.

Desde que se obtuvieron los primeros lechones nacidos por fecundación in vitro (Cheng et al., 1986, Theriogenology 25:146) se hizo evidente el problema de la polispermia en el cerdo. Por este motivo han sido numerosas las publicaciones orientadas a la búsqueda de las condiciones ideales durante la FIV para evitar la entrada masiva de espermatozoides en el ovocito de esta especie. Los esfuerzos investigadores se han centrado en el estudio de los medios de cultivo empleados (Dobrinsky et al., 1996, Biol Reprod 55:1069-1074; Abeydeera et al., 1998, Mol Reprod Dev 51:395-401; Coy et al., 2002, Reproduction 124:279-288), la estandarización de las condiciones de trabajo (Coy et al., 1993a, Theriogenology 39: 1201-1208; Coy et al., 1993b, Theriogenology 40: 539-546; Coy et al., 1993c, Zygote 1: 209-213), el empleo de espermatozoides crioconservados, y a ser posible de origen epididimario (Rath y Niemann 1997 Theriogenology 547:785-793; Romar et al., 2003a, Theriogenology 59:975-986), la comparación de los resultados entre los distintos sistemas de capacitación (Jeong y Yang, 2001, Mol Reprod Dev 59:330-335; Matás et al., 2003 Reproduction 125: 133-141), o el empleo de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) como técnica alternativa a la FIV (Probst et al., 2002, Theriogenology 57:752; García-Roselló et al., 2005, J Androl 27:268-275). Sin embargo, como señalan diversas revisiones sobre el tema (Abeydeera 2002, Theriogenology 57:257-273; Coy y Romar, 2002, Reprod Fert Dev 14:275-286; Wheeler et al., 2004, Reprod Fert Dev 16:15-25), el problema persiste y las soluciones pasan por intentar imitar, en condiciones in vitro, el mecanismo fisiológico de bloqueo de la polispermia que tiene lugar en el oviducto.

Se ha demostrado que en la especie porcina los ovocitos madurados in vitro poseen la misma capacidad para liberar los gránulos corticales (GC) tras la fecundación que los madurados in vivo (Wang et al., 1998, Mol Reprod Dev 49:308-316). Sin embargo, tanto en el cerdo como en la vaca se ha observado una ausencia de endurecimiento o "hardening" tras la reacción cortical en ovocitos madurados y fecundados in vitro (Coy et al., 2002, Reproduction 124:279-288; Romar et al., 2003b, Anim Reprod Sci 85:287-300, Coy et al., 2005, Reproduction 129: 19-26). Una hipótesis posible sería que la anormalmente alta incidencia de polispermia en la especie porcina tras la penetración in vitro no fuera debida a una incompleta reacción cortical (exocitosis de los gránulos corticales), sino a la necesidad prioritaria del endurecimiento de la zona pelúcida como mecanismo de bloqueo de la polispermia frente a otros mecanismos como la proteolisis o remoción de receptores para el espermatozoide mediada por glicosidasas o proteasas de los gránulos corticales.

El DTSP o agente de Lomant (ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester) cuya estructura química es:

es un reactivo químico usado para conjugar moléculas por medio de un enlace covalente. Para ello el grupo químico N-hidroxisuccinimidil (NHS) reacciona con los grupos aminos presentes en los aminoácidos lisina de las proteínas (Lomant y Fairbanks 1976, J Mol Biol 104: 243; Jarausch y Kadenbach 1985, Eur J Biochem 146: 211). Este compuesto químico se encuentra disponible comercialmente.

Otros compuestos que actúan de forma similar, conjugando moléculas por medio de un enlace covalente, son el EGS (Etilen glicol bis [succinimidilsuccinato]), el Sulfo-EGS (Etilen glicol bis[sulfosuccinimidilsuccinato]), el BSOCOES (Bis[2 succinimidooxicarboniloxi) etil] sulfone), el DSP (Ditiobis[succinimidilpropionato]), el DTSSP (3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate]), el DSS (Disuccinimidil suberato), el BS³ (Bis[sulfosuccinimidil] suberate), el DSG (Disuccinimidil glutarato), el DST (Disuccinimidil tartarato), el DFDNB (1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno), el DPDPB (1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]...

1. Un método para fecundación in vitro caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso de endurecimiento de la etapa i) se lleva a cabo utilizando medios químicos, físicos, biológicos o mezcla de estos.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la etapa i) se lleva a cabo mediante la incubación de los ovocitos con al menos un compuesto químico o biológico capaz de formar uniones entre los diferentes componentes de la zona pelúcida.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque la etapa i) se lleva a cabo mediante la introducción de los ovocitos en una solución que contiene al menos un agente químico capaz de formar enlaces covalentes entre proteínas y, opcionalmente un tampón.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque dicho agente formador de enlaces covalentes entre proteínas es un agente químico capaz de formar enlaces covalentes entre los aminoácidos lisina de las glicoproteínas de la zona pelúcida de los ovocitos.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el agente químico capaz de formar enlaces covalentes entre proteínas se selecciona entre el grupo formado por ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen glicol bis [succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS), Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone (BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP), 3,3'-Ditiobis[sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP), Disuccinimidil suberato (DSS), Bis[sulfosuccinimidil]suberate (BS3), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST), 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 1,4-Di-[3'-(2,-piridilditio)-propionamido]butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol (BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH), 1,8-bis-Maleimidodietilenglicol (BM[PEO]2), 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano (BMB), 1,4 bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los mismos.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3 a 6, caracterizado porque el compuesto formador enlaces covalentes entre proteínas es el ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3 a 7, caracterizado porque la etapa i) comprende la incubación de los ovocitos en presencia de 0'03 hasta 1'2 mg/ml de al menos un compuesto formador de enlaces covalentes entre proteínas.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3 a 8, caracterizado porque comprende la incubación de los ovocitos en presencia de al menos un compuesto formador de enlaces covalentes entre proteínas bien desde el inicio del proceso de maduración o bien al final del mismo.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque además incluye el paso de cultivar los ovocitos de origen animal no-humano fecundados con espermatozoides de origen animal no-humano hasta producir un embrión.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque incluye el paso de clonar el embrión animal no-humano por transferencia nuclear.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los ovocitos se seleccionan entre ovocitos porcinos, bovinos, caninos, equinos, ovinos, aviares o de roedores.

13. Una solución para inducir el endurecimiento de la zona pelúcida de ovocitos in vitro, caracterizada porque incluye ovocitos y al menos un agente químico capaz de formar enlaces covalentes entre proteínas.

14. La solución de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente químico se selecciona entre el grupo formado por ácido 3,3-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen glicol bis[succinimidilsuccinato] (EGS), Etilenglicol bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS), Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone (BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato] (DSP), 3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP), Disuccinimidil suberato (DSS), Bis[sulfosuccinimidil]suberate (BS3), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST), 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol (BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH), 1,8-bis-Maleimidodietilenglicol (BM[PEO]2), 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano (BMB), 1,4 bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los mismos.

15. La solución de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizado porque el compuesto formador de enlaces covalentes entre proteínas es el ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).

16. El uso de un compuesto que forma enlaces covalentes entre proteínas en la indución del endurecimiento de la zona pelúcida de ovocitos in vitro.

17. El uso del ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen glicol bis [succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS), Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone (BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP), 3,3'-Ditiobis[sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP), Disuccinimidil suberato (DSS), Bis[sulfosuccinimidil] suberate (BS3), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST), 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol (BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH), 1,8-bis-Maleimidodietilenglicol (BM[PEO]2), 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano (BMB), 1,4 bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los mismos en la indución del endurecimiento de la zona pelúcida de ovocitos in vitro.

18. El uso del ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP) como agente inductor del endurecimiento de la zona pelúcida de ovocitos in vitro.

19. El uso del ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP) como agente anti-polispérmico in vitro.